孔令嚴(yán)，汪 最，邵華斌，張騰飛，盧 琴，羅青平

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

禽源多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是引起禽霍亂的致病菌，在家禽中屬于急性、熱性、高致病性傳染病病原[1]。目前主要采用藥物防治，一些抗生素如土霉素，金霉素等四環(huán)素類藥物效果較好[2]。但由于人類在疾病治療中大量不當(dāng)?shù)厥褂每咕幬?，單重或多重耐藥菌株的出現(xiàn)對(duì)抗生素的使用帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[3]。四環(huán)素類藥物屬于高效、廣譜抗菌藥物。近年來臨床分離出的Pm呈現(xiàn)出對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥現(xiàn)象，部分分離株對(duì)土霉素、四環(huán)素、鏈霉素等藥物已達(dá)到了高度耐藥[4]。細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥機(jī)制主要分為靶基因突變、質(zhì)粒介導(dǎo)、細(xì)胞膜通透性改變和主動(dòng)外排泵系統(tǒng)四種[5]。耐四環(huán)素類藥物的機(jī)制主要包括外排泵機(jī)制、核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制、鈍化或修飾四環(huán)素的酶機(jī)制[6]三類。目前公認(rèn)的Pm耐四環(huán)素類藥物的主要機(jī)制是其質(zhì)?；蛉旧w上攜帶一種或多種外排泵蛋白基因，其他耐藥機(jī)制尚未被闡明。

利用高通量測序技術(shù)可全面了解細(xì)胞或組織中生物信息學(xué)的變化情況，研究人員基于高通量測序原理對(duì)耐藥病原菌展開了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究[7]，為挖掘相關(guān)差異基因開拓了一種新方法，從而可以更加全面的了解其耐藥機(jī)理。

本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)四環(huán)素（Tetracycline，Tet）敏感株與耐藥株進(jìn)行測序分析，從整體水平上了解禽源Pm在Tet耐藥情況下菌體的調(diào)控機(jī)制，以期鑒定出耐藥相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究其耐藥的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑 禽源多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株C48-1購自中國獸藥監(jiān)察所；四環(huán)素耐藥株（TetR）（MIC=32μg/mL）為前期本實(shí)驗(yàn)室體外誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)株C48-1獲得；TSA、TSB培養(yǎng)基購自BD公司；核酸/蛋白紫外檢測系統(tǒng)和BIO-RAD IQ5熒光定量PCR儀購自BIO-RAD公司；SYBR Premix ExTaqTMⅡ和Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa生物公司；RNeasy Mini Kit與RNase-Free DNase Set購自Qiagen公司；RNAClean XP Kit購自Beckman公司；Ribo-Zero rRNA Removal Kits購自Epicentre公司；Agilent Bioanalyzer 2100購自Agilent公司。

1.2 Tet耐藥株的體外誘導(dǎo) 本研究前期采用體外遞增藥物濃度的方法[8]對(duì)C48-1標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行逐步誘導(dǎo)，成功獲得Tet耐藥株（MIC=32 μg/mL）。通過對(duì)靶位基因序列分析以及對(duì)質(zhì)粒攜帶的tetA、tetB、tetG、tetH和tetL耐藥基因的檢測，排除了這幾種外排泵蛋白介導(dǎo)耐藥的可能。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)與總RNA提取 分別挑取標(biāo)準(zhǔn)株C48-1和耐藥菌株TetR的單菌落轉(zhuǎn)接至5 mL TSB培養(yǎng)基，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)；次日以1:100轉(zhuǎn)接至100 mL TSB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.7～0.9；離心收集菌體，經(jīng)無菌生理鹽水洗滌菌體3次后，按照RNeasy Mini Kit (Qiagen)提取試劑盒操作說明進(jìn)行樣品的RNA抽提，并利用Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后純化總RNA。

1.4 測序文庫構(gòu)建與測序 純化后的總RNA按照Ribo-Zero rRNA Removal Kits（Epicentre）提取試劑盒操作說明進(jìn)行rRNA去除，根據(jù)Illumina公司RNA測序文庫構(gòu)建說明書建立測序文庫，由上海伯豪生物技術(shù)有限公司用Illumina HiSeqTM2500進(jìn)行文庫的測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理 將測序得到的原始序列（raw reads）進(jìn)行過濾去雜（去除測序接頭序列、重復(fù)冗余序列、低質(zhì)量序列），獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)（clean reads）。應(yīng)用bowtie2[9]進(jìn)行局部比對(duì)，對(duì)預(yù)處理后reads進(jìn)行基因匹配，以Pm70（NC_002663.1）全基因組作為參照序列，匹配過程中允許有2個(gè)堿基的錯(cuò)配。

1.6 差異基因的篩選 使用FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）法[9]計(jì)算基因表達(dá)量，得到差異檢驗(yàn)FDR（false discovery rate）值的同時(shí)，根據(jù)基因的表達(dá)量（FPKM值）計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，表明表達(dá)差異越顯著。在本試驗(yàn)分析中，差異表達(dá)基因定義為FDR≤0.05且倍數(shù)差異在2倍以上的基因。

1.7 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析 得到差異表達(dá)基因后，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG Pathway分析。首先把所有差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫的各個(gè)條目映射，計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。將差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX比對(duì)，獲得差異表達(dá)基因相對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路注釋信息。通過信號(hào)通路顯著性富集確定差異表達(dá)基因參與的最主要的生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.8 差異表達(dá)基因耐藥基因注釋 通過耐藥基因數(shù)據(jù)庫（antibiotic resistance genes database，ARDB）對(duì)差異表達(dá)基因的耐藥性進(jìn)行注釋，獲得耐藥性相關(guān)基因的名稱及其所耐受的抗生素種類等信息。

1.9 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證 將1.3中提取的樣品總RNA按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）的反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備其cDNA，置于-40℃保存?zhèn)溆谩ｋS機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)基因，以Pm保守基因16S rRNA為參照基因，利用SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）在CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）中按照MIQE 國際化標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測[10]，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接與評(píng)估 對(duì)C48-1親本敏感株及其Tet耐藥株的總RNA提取質(zhì)檢合格后，共建立了4個(gè)轉(zhuǎn)錄測序文庫，采用Illumina HiSeqTM2500進(jìn)行測序，去除不合格的reads后得到可用于數(shù)據(jù)分析的clean reads，以NCBI數(shù)據(jù)庫中的Pm70（NC_002663.1）全基因組作為參照，對(duì)4組clean reads進(jìn)行基因匹配，結(jié)果基因比對(duì)率均達(dá)到97.73%以上，可以進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.2 表達(dá)差異基因的篩選 根據(jù)每個(gè)基因的FPKM值進(jìn)行樣本間表達(dá)基因相關(guān)性分析，TetR菌株與C48-1菌株之間的基因表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.907；以Q值≤0.05，差異倍數(shù)≥2為條件篩選表達(dá)差異基因。結(jié)果共篩選出442個(gè)有意義的差異表達(dá)基因，其中103個(gè)上調(diào)，339個(gè)下調(diào)（圖1）?；虮磉_(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖與火山圖中，紅色代表的是上調(diào)表達(dá)基因，藍(lán)色代表的是下調(diào)表達(dá)基因，篩選出的表達(dá)差異基因中以下調(diào)表達(dá)為主。

圖1 基因表達(dá)差異分布圖Fig.1 Distribution of differentially expressed genes

2.3 差異表達(dá)基因的GO與KEGG富集分析以及耐藥基因ARDB注釋

2.3.1 差異表達(dá)基因的GO富集分析 將篩選出的442個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，主要分為3個(gè)類別：分子功能（molecular function）、細(xì)胞成分（cellular component）、生物過程（biological process）。將442個(gè)差異表達(dá)基因通過GO富集得到69個(gè)GO條目，其中233個(gè)差異表達(dá)基因（大多數(shù)為下調(diào)表達(dá)）富集到排名前30的GO條目中（表1），差異表達(dá)基因主要集中于核糖體的結(jié)構(gòu)成分、rRNA結(jié)合、電子載體活性、ATP酶活性介導(dǎo)物質(zhì)的跨膜運(yùn)動(dòng)、周質(zhì)空間、外膜周質(zhì)空間、跨膜運(yùn)輸、多糖生物合成、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)生物過程。除多糖生物合成外，其他生物過程多數(shù)富集于核糖體結(jié)合與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)等功能，參與跨膜運(yùn)輸過程，表明Tet耐藥可能與細(xì)胞膜運(yùn)輸功能及核糖體構(gòu)型有密切關(guān)系。

2.3.2 差異表達(dá)基因的KEGG注釋與富集性分析 篩選得到的442個(gè)差異表達(dá)基因通過KEGG數(shù)據(jù)庫共注釋到20個(gè)通路類別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因主要分布于整體概觀圖96個(gè)，膜運(yùn)輸40個(gè)，碳代謝35個(gè)，氨基酸代謝34個(gè)，輔助因子與維生素代謝26個(gè)，翻譯過程24個(gè)，脂質(zhì)代謝21個(gè)以及其他通路。442個(gè)差異表達(dá)基因通過KEGG pathway富集得到90個(gè)通路條目，其中有172個(gè)差異表達(dá)基因（大多數(shù)為下調(diào)表達(dá)）富集到排名前30的通路條目中（圖2），而172個(gè)差異基因中有47個(gè)基因分布在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和核糖體代謝途徑中。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中上調(diào)基因21個(gè)，下調(diào)基因8個(gè)；核糖體代謝途徑中18個(gè)基因全為下調(diào)，說明禽源Pm四環(huán)素耐藥機(jī)制可能與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和核糖體代謝途徑有關(guān)。由于雙組分系統(tǒng)通路中差異基因大多數(shù)為上調(diào)表達(dá)，且該系統(tǒng)可以起到調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，所以篩選出ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和雙組分系統(tǒng)中差異極顯著的前16個(gè)過量表達(dá)基因，以及核糖體代謝途徑中下調(diào)最顯著的4個(gè)基因（表2）。

表1 TetR菌株差異表達(dá)基因前30 GO富集表Table 1 Top 30 of GO enrichment of differentially expression genes of TetR strain

2.3.3 差異表達(dá)基因耐藥基因（ARDB）注釋 將TetR菌株中篩選出的442個(gè)差異表達(dá)基因在ARDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋，結(jié)果共匹配出2種耐藥相關(guān)基因且上調(diào)倍數(shù)顯著，分別是核糖體保護(hù)蛋白（tnaA）、主要易化子超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PM_RS03880）（表3），進(jìn)一步說明禽源Pm四環(huán)素耐藥可能是由外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)和核糖體保護(hù)蛋白協(xié)同作用所引起。

圖2 差異表達(dá)基因的KEGG通路分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.2 KEGG pathway classifi cation statistical fi gure of differentially expressed genes

表2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、雙組份系統(tǒng)和核糖體代謝通路中差異表達(dá)基因Table 2 Differentially expression genes of ABC transporters、two-component system and ribosome pathway

表3 TetR菌株耐藥基因注釋表Table3 Resistant genes annotation of TetR strain

2.4 差異基因的mRNA熒光定量PCR檢測 按照MIQE標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR 的檢測結(jié)果與RNA-Seq分析結(jié)果一致（圖3），10個(gè)差異表達(dá)基因在qRTPCR 和RNA-Seq中的誘導(dǎo)表達(dá)變化趨勢相同，證實(shí)了RNA-Seq 分析結(jié)果的可靠性。兩種分析方法檢測出的表達(dá)倍數(shù)有一定差異，這可能與兩種檢測方法的檢測范圍和靈敏度不同有關(guān)。

圖3 TetR差異表達(dá)基因驗(yàn)證Fig.3 Validation of differentially expression genes by qRT-PCR

3 討論

四環(huán)素類抗生素是抑制細(xì)菌蛋白合成的一類廣譜抗生素，因其對(duì)禽巴氏桿菌有良好殺滅作用而被廣泛應(yīng)用，但隨之而來的細(xì)菌耐藥性問題也日趨嚴(yán)重。在國內(nèi)，關(guān)于巴氏桿菌對(duì)四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制的研究報(bào)道相對(duì)較少，而國外學(xué)者對(duì)耐藥機(jī)制的研究主要關(guān)注于Pm可在質(zhì)粒上攜帶tetA、tetB、tetG、tetH和tetL等多種四環(huán)素類外排泵蛋白基因[11]，其他耐藥機(jī)制則未見詳細(xì)研究報(bào)道。

本研究前期采用體外逐步誘導(dǎo)法對(duì)禽源Pm親本敏感株進(jìn)行誘導(dǎo)，成功獲得TetR耐藥株，并對(duì)TetR耐藥株進(jìn)行了耐藥基因tetA、tetB、tetG、tetH和tetL的檢測，結(jié)果并未檢測到上述耐藥基因，從而排除了這幾種外排泵蛋白介導(dǎo)耐藥的可能性。

本研究將差異表達(dá)基因富集到排名前30的GO條目中發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因一方面集中于核糖體的結(jié)構(gòu)成分，而核糖體的結(jié)構(gòu)成分變化可能與核糖體的構(gòu)型變化有關(guān)。有研究表明核糖體保護(hù)蛋白與核糖體結(jié)合可引起核糖體構(gòu)型的改變，從而使四環(huán)素不能與其結(jié)合，但并不改變或阻止自身蛋白的合成[12]。差異表達(dá)基因另一方面集中于周質(zhì)和外膜周質(zhì)空間的變化，許多外排泵蛋白存在于雙分子脂膜中，以親水氨基酸環(huán)凸出到周質(zhì)和外膜周質(zhì)空間，從而外輸泵蛋白逆濃度梯度將四環(huán)素-陽離子復(fù)合物泵出胞外[13]，表明外排泵介導(dǎo)了四環(huán)素耐藥。因此四環(huán)素耐藥可能與外排泵系統(tǒng)和核糖體保護(hù)蛋白有關(guān)。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路分析發(fā)現(xiàn)，富集到前30通路條目中的絕大部分基因都分布于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與核糖體代謝途徑中。米陽等[14]將分離株MZ1006外排泵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因msbA和spab敲除后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)克拉霉素、氯霉素、氧氟沙星和利福平的敏感性顯著上升，說明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以起到多重耐藥的作用。

核糖體代謝途徑中PM_RS01130（rpmE）下調(diào)最顯著，rmpE編碼50S核糖體蛋白L31，有研究表明缺失rpmE基因的沙門氏菌會(huì)影響鎂離子運(yùn)輸?shù)鞍譵gtA的轉(zhuǎn)錄水平[15]。四環(huán)素穿過細(xì)菌外膜是以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)陽離子(可能是Mg2+)-四環(huán)素復(fù)合物的形式經(jīng)OmpF、OmpC 孔蛋白通道[16]，所以PM_RS01130可能是一個(gè)重要的耐藥相關(guān)基因。另外3個(gè)下調(diào)基因PM_RS09065、PM_RS09070、PM_RS07215均編碼30S核糖體蛋白，四環(huán)素類抗生素通過與胞內(nèi)核糖體30S亞基形成可逆結(jié)合體，抑制蛋白質(zhì)合成，起到抗菌效果[17]。多個(gè)核糖體基因的下調(diào)是一種自我保護(hù)機(jī)制，可能是由保護(hù)核糖體蛋白與核糖體結(jié)合所引起的。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與雙組分系統(tǒng)通路中差異基因大多數(shù)為上調(diào)表達(dá)。Sebastian等[18]發(fā)現(xiàn)雙組份系統(tǒng)與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間有著密切的關(guān)聯(lián)，它們可以調(diào)控對(duì)刺激的感知、信號(hào)的傳導(dǎo)以及通過Bcelike解毒系統(tǒng)起到耐藥作用。兩條通路上調(diào)的基因中PM_RS08570、PM_RS04835、PM_RS07920、PM_RS01405編碼的蛋白均為C4-二羧酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其有5個(gè)不同種類的蛋白，分別為DctA、DcuA、DcuB和兩個(gè)同源的DcuC，它們通過雙組份RacRS系統(tǒng)來應(yīng)對(duì)低氧和高硝酸鹽環(huán)境，調(diào)控C4-二羧酸鹽跨膜運(yùn)輸[19]，這類蛋白很可能是介導(dǎo)四環(huán)素耐藥的外排泵，而 PM_RS10285和PM_RS08580編碼的蛋白為C4-二羧酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶，能夠與C4-二羧酸鹽特異結(jié)合，通過自身構(gòu)象的變化，將C4-二羧酸鹽轉(zhuǎn)移到膜的另一側(cè)[20]。PM_RS10285編碼的蛋白為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通透酶，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核心是由跨膜域和核苷酸結(jié)合域組成，是最大的膜蛋白類之一[21]。通透酶是物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)妮d體，可能與藥物的外排有關(guān)。PM_RS07150、PM_RS07145和PM_RS00780編碼的蛋白均為核糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者通透酶，起到運(yùn)輸核糖的作用。核糖與腺苷酸的形成和三磷酸腺苷（ATP）的再生有密切關(guān)系，是生命代謝最基本的能量來源之一，可以為藥物外排提供能量。

uhpT蛋白為膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，缺失掉uhpT基因后金黃色葡萄球菌對(duì)磷霉素MIC由0.5 μg/mL變?yōu)?2 μg/mL，缺失株恢復(fù)uhpT基因后金黃色葡萄球菌對(duì)磷霉素MIC由32 μg/mL變?yōu)?.5 μg/mL[22]，表明uhpT蛋白過表達(dá)與耐藥有關(guān)。PM_RS10290編碼的蛋白為ABC多藥外排泵，可以將對(duì)菌體有害的多種藥物排出體外。差異表達(dá)基因用ARDB進(jìn)行耐藥基因注釋后得到兩種耐藥相關(guān)基因，PM_RS03880編碼的蛋白為主要易化子超家族的外排泵蛋白，主要介導(dǎo)四環(huán)素的外排作用。Manabu等[23]發(fā)現(xiàn)從漁場分離的細(xì)菌如含有tetY基因，就會(huì)對(duì)所有四環(huán)素類藥物耐藥。tnaA為核糖體保護(hù)蛋白，可以保護(hù)核糖體不被四環(huán)素陽離子復(fù)合物抑制翻譯過程。

綜上所述，禽源Pm對(duì)四環(huán)素耐藥可能由細(xì)胞膜上多藥外排泵的過量表達(dá)和核糖體保護(hù)蛋白兩種耐藥機(jī)制協(xié)同作用所引起。后期需要對(duì)相關(guān)耐藥基因構(gòu)建缺失株，以進(jìn)一步驗(yàn)證禽源Pm對(duì)四環(huán)素耐藥的機(jī)制。本研究結(jié)果為深入研究細(xì)菌耐藥分子機(jī)制提供重要依據(jù)。