蔡國林，劉逸凡，李曉敏，陸健*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

微生物胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)是微生物在生長、代謝過程中分泌到細胞外的一類長鏈多糖[1-2]。對微生物細胞而言，EPS可以保護其對抗干燥、有毒害物質、噬菌體和滲透壓等環(huán)境脅迫[3-4]。EPS具有水溶性、保濕性、增稠性和乳化性等物理化學特性，因此被廣泛應用于食品工業(yè)中，如乳酸菌EPS可以改善發(fā)酵乳的黏度、質構和口感，是一種潛在的食品穩(wěn)定劑[5-7]。此外，EPS還具有特殊的生理活性，如降低膽固醇、抗腫瘤和調節(jié)機體免疫能力等[8-9]，是功能性保健產品和醫(yī)藥產品的重要成分。

近年來，EPS作為益生元促進腸道內有益微生物的生長和活性，進而調節(jié)腸道菌群、改善宿主健康成為EPS的研究熱點[10-11]。由于EPS產生菌不同，這些EPS具有不同的組成和結構，因此其對有益菌的增殖效應也不相同。然而，目前對這些EPS的益生特性僅僅停留在是否增殖上，對增殖的益生菌的代謝及生理特性是否有影響和影響機制都缺乏深入的研究。目前，研究EPS的益生元特性主要集中在乳酸菌和雙歧桿菌等公認安全的菌株，它們產生的EPS主要包括β-葡聚糖，β-果聚糖，α-葡聚糖和一些異元多糖[12-15]。然而，乳酸菌和雙歧桿菌胞外多糖產量有限，大部分菌株EPS產量在1 g/L以下，限制其商業(yè)化應用[12]。而在我們前期的研究中發(fā)現，解淀粉芽孢桿菌JN4是一種潛在的益生菌，且EPS產量在20 g/L以上[16]，遠高于乳酸菌的EPS產量，但其益生元特性還尚未有文獻報道。

本研究主要通過考察解淀粉芽孢桿菌JN4的胞外多糖EPS-JN4對腸道微生物的增殖作用及其對乳酸菌生長和代謝產物的影響，同時研究EPS-JN4對增殖的乳酸菌腸道耐受性和表面疏水性的影響及其初步影響機制，為其作為益生元的應用提供良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 解淀粉芽孢桿菌胞外多糖EPS-JN4的制備

將實驗室保藏的解淀粉芽孢桿菌JN4活化，并接種至添加100 g/L蔗糖的LB培養(yǎng)基上，37 ℃、200 r/min發(fā)酵72 h，發(fā)酵液12 000×g、4 ℃離心20 min，向上清液中加入3倍體積的預冷無水乙醇進行過夜醇沉，12 000×g， 4 ℃離心20 min，用去離子水重新溶解沉淀，加入1/4體積的Sevage試劑(V(正丁醇)∶V(氯仿)=1∶5)除去蛋白質。將水相置于截留分子質量為8 000 u的透析袋中，透析72 h，每8 h換1次水，然后真空冷凍干燥，得到粗多糖。將粗多糖溶于50 mmol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中(10 g/L)，用Hitrap DEAE FF離子交換色譜進行分離純化，用含有1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，按峰收集含糖組分并冷凍干燥。取經過離子交換柱純化的多糖組分溶于適量50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，用Sepharose Cl-6B進行凝膠過濾層析，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集合并多糖組分，透析，冷凍干燥，得到純化多糖EPS-JN4。

1.2 EPS-JN4對腸道微生物群落的增殖作用

以健康成年雞的新鮮糞便為樣本，采用體外發(fā)酵的方法考察EPS對腸道微生物群落的增殖作用[17]?；A培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白胨 2，明膠蛋白 2，酵母粉 7.5，半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，氯化血紅素 0.05，MnCl2·4H2O 0.05，NaHCO32，CaCl20.2，MgSO40.2，K2HPO41，NH4Cl 0.5，CoCl2·6H2O 0.05。以不添加碳源的基礎培養(yǎng)基作為陰性對照，添加10 g/L葡萄糖作為陽性對照，添加10 g/L EPS-JN4作為實驗組，121 ℃滅菌20 min。各組培養(yǎng)基滅菌冷卻后，加入0.1% 過濾除菌的維生素溶液(mg/L)：VK31，生物素2，VB120.5，泛酸鈣10，煙酰胺5，對氨基苯甲酸5，硫胺素4。

收集4只健康成年雞的糞便于250 mL滅好菌的離心管中，將其懸浮于無菌的0.1 mol/L pH 7.3的PBS緩沖液中，加無菌玻璃珠渦旋1 min，靜置取上清液。將上清液以1%分別接種于上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液離心(8 000×g，4 ℃，10 min)， 收集菌體進行DNA提取。采用糞便基因組抽屜試劑盒進行DNA提取。采用具有細菌16S rDNA基因的V3區(qū)通用引物F341-GC和R518進行擴增，隨后進行變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)，對DGGE上的優(yōu)勢條帶進行切膠回收并測序。

1.3 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125生長的影響

以常見的益生元低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)為參照，考察EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125生長的影響，羅伊氏乳桿菌JN125分離至上述雞糞便發(fā)酵液。GOS和EPS-JN4的儲備液(10%)用去離子水溶解，并經0.45 μm過濾除菌。GOS和EPS作為唯一碳源按10 g/L分別添加至基礎MRS培養(yǎng)基中，接種5%的乳酸菌菌懸液(105CFU/mL)，在35 ℃ 靜置培養(yǎng)72 h。以添加葡萄糖或不添加碳源分別作為陽性和陰性對照，每隔12 h取樣檢測乳酸菌數。

1.4 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125代謝產酸的影響

采用1.3的培養(yǎng)方法，分別在24、48和72 h取樣，樣品經離心，采用HPLC方法分析發(fā)酵液中有機酸(乳酸和醋酸)組成[18]。

1.5 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125腸道耐受性的影響

在上述培養(yǎng)基中接種5%的乳酸菌菌懸液(108CFU/mL)， 過夜培養(yǎng)，5 mL離心，用pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌3次，溶解在500 μL PBS中。取100 μL菌懸液加至900 μL的人工模擬腸液中，37 ℃振蕩水浴處理2 h后進行活菌計數[19]，每個處理重復3次。人工模擬腸液：取KH2PO46.8 g，加蒸餾水500 mL溶解，用0.1 mol/L的NaOH調節(jié)pH至6.8，加水定容至1 000 mL，加入1.0 g胰蛋白酶和3.0 g牛膽鹽，充分溶解后經0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。

1.6 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125表面疏水性的影響

將待測菌液于4 ℃，10 000×g下離心5 min，收集菌體，用無菌的PBS緩沖液(pH=7.2)洗滌兩次，用PBS緩沖液調整菌體濃度使其吸光度為1.00(OD560)。取3 mL菌液，分別加入0.6 mL的十六烷和甲苯，充分混合，待其靜置分層后，取下層水相測定吸光度(OD560)[20]。表面疏水性計算見公式(1):

(1)

式中，A0為菌液與吸附劑混合前的吸光度；A為菌液與吸附劑混合后的吸光度。

1.7 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125細胞膜成分的影響

離心獲得菌體，分別用蛋白質和脂類提取緩沖液重新懸浮，80 000 Hz超聲提取5 min，離心去掉殘渣，并測定蛋白質和脂類物質的含量，結果以占細胞干重的比例顯示[18]。

細胞膜脂肪按照邱然等的方法進行制備和甲基化，然后采用GC-MS的方法進行測定(Thermo Scientific TRACE 1310，ISQ LT)。細胞膜脂肪酸峰面積總和認為是100%，根據每種脂肪酸峰面積占總峰面積的比例計算脂肪酸的相對質量分數[21]。

1.8 數據分析

數據分析采用SPSS 17.0進行，每個實驗均重復3次，數據以平均值±標準偏差表示，并進行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 EPS-JN4對腸道微生物的增殖作用

以不添加碳源和添加葡糖糖分別作為陰性和陽性對照，通過RCR-DGGE的方法研究EPS在厭氧情況下對腸道細菌體外發(fā)酵24 h后微生物群落結構的變化情況，結果如圖1所示，對圖1中的主要條帶進行測序，比對結果如表1所示。由圖1可以看出，在不添加碳源培養(yǎng)基中的優(yōu)勢菌有沙門氏菌和盲腸腸球菌；添加葡萄糖培養(yǎng)基中的優(yōu)勢菌主要有糞腸球菌和盲腸腸球菌，糞腸球菌是一種常見的乳酸菌，它的增殖有效抑制了沙門氏菌的生長；添加EPS-JN4培養(yǎng)基中的優(yōu)勢菌主要有羅伊氏乳桿菌、糞腸球菌、盲腸腸球菌和乳酸鏈球菌，與葡萄糖相比，EPS-JN4組乳酸菌的種類比較豐富，可能和其可以特異性增殖羅伊氏乳桿菌和乳酸鏈球菌，而這兩種乳酸菌在實驗樣品中的數量較少有關。

B-不添加碳源的陰性對照；C-添加葡萄糖的陽性對照；E-添加EPS的試驗組圖1 EPS-JN4對雞糞便菌群PCR-DGGE圖譜的影響Fig.1 Effect of EPS-JN4 on the DGGE fingerprint of faeces microbial community

表1 PCR-DGGE主要條帶測序比對結果Table 1 Sequence comparison of main bands in PCR-DGGE by sequencing and BLAST analysis

條帶菌種菌種編號 相似度/%1Lactobacillusagilis DSPV005PKU295174.1992Escherichia coli O104CP024992.1993UnculturedLactococcus HEF1MF148187.1994Lactobacillus reuteri F275NR_025911.11005Enterococcus faecium LMG11423NR_042054.11006Enterococcus cecorum x242-3-96KX674359.1997Streptococcus lactis NCDO607NR_040954.1998Pediococcus acidilactici NGRI0510QNR_041640.11009Salmonella KU641452.1MG663489.19910Lactobacillusingluviei 29cKR492882.199

從EPS-JN4的雞糞便發(fā)酵液中分離獲得乳桿菌和乳球菌159株，經16S rDNA鑒定，將其中的1株羅伊氏乳桿菌JN125用于后續(xù)研究，考察EPS-JN4對其生長和代謝的影響。

2.2 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125生長的影響

以葡萄糖和常見的益生元GOS為對照，考察EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125生長的影響，結果如圖2所示。

圖2 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125生長的影響Fig.2 Effect of EPS-JN4 on the growth of Lactobacillus reuteri JN125

由圖2可知，EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125具有明細的增殖作用。在前24 h里，葡萄糖組的增殖速度最快，達到6.3×107CFU/mL，而GOS和EPS-JN4組增長較慢，分別為1.3×106CFU/mL和6.3×105CFU/mL。但在隨后的24 h里，葡萄糖組基本保持穩(wěn)定，達到最高的1.2×109CFU/mL，而GOS和EPS-JN4組的增殖速度加快，在48 h時達到了3.2×109和6.3×109CFU/mL， 分別為葡萄糖組最高時的2.67和5.25倍。GOS是1種以半乳糖為主要成分的益生元，前期的研究結果表明，EPS-JN4的主要成分為葡萄糖、半乳糖和氨基半乳糖，兩者都富含半乳糖，這可能是它們具有相似的特異性增殖作用的原因。

2.3 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125代謝產物的影響

乳酸和醋酸是乳酸菌的主要代謝產物，EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125代謝產生乳酸和醋酸的影響如表2所示。

表2 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125代謝產生 乳酸和醋酸的影響Table 2 Effect of EPS-JN4 on the production of lactic acid and acetic acid by Lactobacillus reuteri JN125

注：同一行相同字母表示不存在顯著性差異。下同。

由表2可以看出，葡萄糖組較GOS組和EPS-JN4組產生更多的乳酸和醋酸，表明GOS和EPS-JN4可能更多地被羅伊氏乳桿菌JN125用于菌體生長，或代謝形成其他產物有關。另外，較低的乳酸和醋酸含量也可能降低了產物抑制作用[22]，從而達到更高的菌濃。

2.4 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125腸道耐受性的影響

比較葡萄糖、GOS和EPS-JN4增殖的羅伊氏乳桿菌JN125的腸道耐受性結構如表3所示。由表3可知，EPS-JN4和GOS增殖的羅伊氏乳桿菌JN125的腸道耐受性顯著提高，這也意味著其在腸道存活下來并定殖的可能性增加。膽鹽能夠改變乳酸菌細胞膜的通透性，從而抑制其生長，同一菌株在不同培養(yǎng)基下腸道耐受性的改變，表明其細胞膜組成可能發(fā)生變化。

表3 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌人工腸液耐受性的影響Table 3 Effect of EPS-JN4 on the intestinal juice tolerance of Lactobacillus reuteri JN125

2.5 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125表面疏水性的影響

比較葡萄糖、GOS和EPS-JN4增殖的羅伊氏乳桿菌JN125表面疏水性的影響，結果如圖3所示。

圖3 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125表面疏水性的影響Fig.3 Effect of EPS-JN4 on thehydrophobicity of Lactobacillus reuteri JN125

由圖3可知，EPS-JN4和GOS增殖的羅伊氏乳桿菌JN125表面疏水性顯著提高，分別提高了69.7%和44.5%。由于菌株對腸道黏膜的黏附特性與表面疏水性成正相關，表面疏水性高的菌株更有利于腸道定殖[23]。結合腸道耐受性改變的結果分析，表明和葡萄糖增殖的羅伊氏乳桿菌JN125相比，EPS-JN4和GOS增殖的羅伊氏乳桿菌JN125的細胞膜組成可能發(fā)生了改變。

2.6 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125細胞膜蛋白和脂類物質的影響

比較葡萄糖、GOS和EPS-JN4增殖的羅伊氏乳桿菌JN125細胞膜蛋白質和脂類物質含量的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，GOS和EPS-JN4增殖的羅伊氏乳桿菌JN125細胞膜蛋白質和脂類物質含量顯著提高，其中蛋白質含量提高了36.8%和40.8%，脂類物質含量增加了97.9%和105.7%。細胞膜是乳酸菌與外界環(huán)境接觸的重要細胞結構，其組成與細胞應對環(huán)境脅迫密切相關[24]。

圖4 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125細胞表面蛋白和脂類含量的影響Fig.4 Effect of EPS-JN4 on the protein and lipid content of Lactobacillus reuteri JN125

進一步對細胞膜脂肪酸組成進行分析，結果如表4所示。

表4 EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌細胞膜脂肪酸組成的影響 單位：%(質量分數)

注：“-”表示未檢出。

由表4可知，羅伊氏乳桿菌JN125細胞膜脂肪酸主要由十六碳，十七碳和十八碳脂肪酸組成，不同培養(yǎng)基增殖的羅伊氏乳桿菌JN125這3類脂肪酸占總脂肪酸的比例差異不顯著，但GOS和EPS-JN4組的十八碳脂肪酸和不飽和脂肪酸比例明顯高于葡萄糖組。由于乳酸菌膜脂肪酸組成在其耐受乙醇脅迫和酸脅迫方面也起到重要的調控作用，而且乳酸菌細胞膜脂肪酸的不飽和度決定了細胞膜的厚度和黏度，進而提高對環(huán)境脅迫的適應性[25]。因此，可推測在EPS-JN4存在的情況下，羅伊氏乳桿菌JN125細胞膜脂肪酸碳鏈長度增加，使得脂肪酸能容易橫跨膜雙分子層，并通過疏水作用與其他脂類和蛋白質結合，使脂肪酸鏈顯得更緊湊，增加膜的穩(wěn)定性，從而提高腸道耐受性和疏水性[25]。

3 結論

解淀粉芽孢桿菌JN4的胞外多糖EPS-JN4對雞糞便菌群中乳酸菌具有特異性的增殖作用，特別是對羅伊氏乳桿菌和乳酸鏈球菌具有很好的增殖作用。EPS-JN4對羅伊氏乳桿菌JN125的前期增殖速度較葡萄糖慢，但最高菌濃為葡萄糖的5.25倍。EPS-JN4還對羅伊氏乳桿菌JN125代謝產酸有影響，乳酸和醋酸含量較葡萄糖組分別降低了12.2%和32.4%。EPS-JN4增殖的羅伊氏乳桿菌JN125的腸道耐受性顯著提高，表面疏水性提高了69.7%，對其影響原因初步分析表明細胞膜蛋白和脂類物質含量提高了40.8%和105.7%，十八碳脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例顯著提高。