李曉藝，王宏艷，馬良,3，戴宏杰，余永，張宇昊,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(河北金融學院，河北 保定，071051) 3(西南大學，國家食品科學與工程實驗教學中心，重慶，400715)

明膠是膠原蛋白部分水解的產(chǎn)物[1]，食品工業(yè)中常被大量應用于甜味食品，如軟糖、糕點、酸奶、飲料等，因此甜味劑對明膠凝膠特性的研究受到了廣泛關(guān)注。CHOI等[2]研究發(fā)現(xiàn)明膠-糖復合體系隨著儲存時間的延長，儲能模量G′與膠凝速率常數(shù)K增幅的順序為：木糖<葡萄糖<蔗糖，說明蔗糖對其周圍水分子的結(jié)構(gòu)有最大的穩(wěn)定作用。KUAN等[3]對鴨足明膠和蔗糖、乳糖復合體系進行了結(jié)構(gòu)及流變學研究，分析認為低糖濃度(50～100 g/L)下糖阻礙了明膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形成，而在高濃度(400 g/L)時由于形成更小的連接區(qū)使凝膠結(jié)構(gòu)更穩(wěn)固。

隨著人們對健康飲食的追求，糖類物質(zhì)受高熱量、易導致齲齒以及糖尿病等因素限制[4]，需求量下降，糖替代品及甜味劑的應用開始流行。糖醇是羰基加氫生成的多元醇化合物，可改善蛋白質(zhì)部分功能，如熱穩(wěn)定性、乳化性及膠凝性等[5-6]。山梨糖醇的甜度約為蔗糖的60%～70%，人體攝入后不會轉(zhuǎn)化為葡萄糖，不受胰島素影響，且不易與蛋白質(zhì)產(chǎn)生美拉德反應[7]，是理想的蔗糖替代物。目前，糖醇對明膠凝膠特性的影響有少量研究，GEKKO等[8]研究發(fā)現(xiàn)明膠凝膠的熔化溫度隨著多元醇和糖的濃度增加而增加，而明膠溶液的黏度隨著多元醇的添加而降低。但該研究主要針對明膠在溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程中的變化，并未闡明復合體系中凝膠特性的變化及其分子機制。

本課題組研究表明[9-10]，兔皮明膠具有良好的凝膠特性，且不受宗教和疫病的局限，具有良好的應用前景。因此，本研究系統(tǒng)探究了不同濃度的山梨糖醇對兔皮明膠功能特性的影響，以期為此復合凝膠體系在食品工業(yè)中的應用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔皮，重慶阿興記食品有限公司，清洗后于-20 ℃冰箱中凍藏備用。Ca(OH)2、HCl、Na2S、NaCl、過硫酸銨、二甲基硅油、十二烷基硫酸鈉、蔗糖，成都市科龍化工試劑廠；β-巰基乙醇(2-ME)、Tris、考馬斯亮藍R-250、四甲基乙二胺(TEMED)，BIO BASIC公司；30%丙烯酰胺、山梨糖醇，北京索萊寶科技有限公司。其中Tris、考馬斯亮藍R-250、30%丙烯酰胺為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA3003B型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；PE20型實驗室pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HX-1005恒溫循環(huán)器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TA.XT2i物性測定儀，英國Stable Micro System公司；DHR-1流變儀，美國TA公司；Spectrun100紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；Pyris4000差示量熱掃描儀，美國PerkinElmer公司；MOS-500圓二色譜儀，法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 兔皮明膠的提取

兔皮明膠的提取參照楊暉等[11]的方法，具體工藝如下：

兔皮→去除皮下脂肪→脫毛→清洗、剪切→去除雜蛋白→清洗→稀酸處理→提膠→過濾→熱風干燥→成品明膠

1.3.2 樣品的配制

用蒸餾水配制質(zhì)量濃度分別為0、30、50、100和200 g/L的山梨糖醇溶液各30 mL，分別加入2 g明膠，室溫下溶脹30 min后于60 ℃溶解1 h，充分攪拌后，于60 ℃繼續(xù)穩(wěn)定30 min得到明膠質(zhì)量濃度為66.7 g/L的共混溶液，室溫下冷卻成膠。

1.3.3 凝膠強度的測定

參照GB6783—2013[12]的測定方法，將1.3.2中制備的樣品在恒溫循環(huán)器中于(10±0.1)℃下凝凍16～18 h，采用TA.XT2i物性測定儀測定凝膠強度。用TA5圓柱型探頭以1 mm/s的速度下壓4 mm，得到凝膠強度數(shù)值。

1.3.4 流變性能的測定

采用DHR-1流變儀測定樣品的流變學行為，測試夾具為直徑40 mm的平板，板間距1 000 μm，動態(tài)溫度掃描的參數(shù)設(shè)置主要參照陳麗清等[13]并做適當調(diào)整，取適量樣品于加熱板上，降下夾具，以2 ℃/min由40 ℃冷卻到5 ℃，于5 ℃下保持2 min，然后由5 ℃ 升到40 ℃，測定儲能模量G′和耗能模量G″隨溫度變化的變化；升溫和降溫過程中，G′和G″的交點對應的溫度分別為明膠的熔化和膠凝溫度。頻率掃描參數(shù)設(shè)置如下：穩(wěn)定時間5 min，測試溫度20 ℃，0.1% 應力值，頻率變化0～100 Hz，測定儲能模量G′和耗能模量G″隨頻率變化的變化。

1.3.5 凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度和熱焓值測定

稱取1.3.2中的樣品3～5 mg，置于鋁坩堝中并密封，進行差示量熱掃描。在氮氣流中以2 ℃/min的速率將系統(tǒng)溫度由-5 ℃升至50 ℃[14]。記錄吸熱峰峰值對應的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度Tm和熱焓值ΔH。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜掃描

分別取一定量的各樣品，冷凍干燥后剪碎。稱取1 mg樣品與100 mg溴化鉀混合后于瑪瑙研缽中研磨，40 ℃烘干后壓片，用紅外光譜儀掃描400～4 000 cm-1的吸收光譜，掃描次數(shù)為32次，分辨率4 cm-1[15]，采用Peak Fit v 4.0軟件對圖譜進行基線校正和分析。

1.3.7 圓二色譜掃描

用蒸餾水將1.3.2中的明膠樣品稀釋至1 mg/mL的溶液，進行圓二色譜掃描。掃描的波長范圍為190～240 nm，溫度25 ℃，比色皿光程1 mm，掃描速率50 nm/min[16]。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.6和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，每個試驗設(shè)置3次平行實驗，最終結(jié)果以平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強度

如圖1所示，添加山梨糖醇后，明膠凝膠強度顯著增大(P<0.05)，當山梨糖醇質(zhì)量濃度增加至50 g/L時，凝膠強度達到最大值540 g。

圖1 含有不同濃度山梨糖醇明膠的凝膠強度Fig.1 Gel strength of gelatin containing sorbitol at different concentrations注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。

繼續(xù)增大山梨糖醇的濃度，凝膠強度有所下降，但均高于對照組。研究認為[17]，多元醇分子上的—OH基團增強了水分子的氫鍵結(jié)構(gòu)，明膠與相鄰水分子的三維氫鍵結(jié)構(gòu)互相連結(jié)，形成了明膠-水-多元醇三元復合穩(wěn)定體系，從而增大明膠的凝膠強度。隨著山梨糖醇濃度持續(xù)增大，凝膠強度與最大值相比顯著下降(P<0.05)。這是由于過高濃度的糖醇存在時，它們與水強力結(jié)合，搶奪了部分復合體系中的水分子[18]，導致體系凝膠強度下降。CAI等[19]將不同濃度的木糖醇加入魚皮明膠中，凝膠強度均顯著提高，并于木糖醇質(zhì)量濃度為30 g/L時達到最大值，與本研究結(jié)果一致。

2.2 流變性能

2.2.1 溫度掃描

升溫過程中，明膠發(fā)生凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變，其網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)受熱不穩(wěn)定，逐漸由有序的螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲，明膠由彈性主導過渡到黏性主導；在溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程中，隨著溫度的不斷下降，無規(guī)則明膠的蛋白分子鏈開始聚集，由粘性主導向彈性主導轉(zhuǎn)變[20-21]。由圖2-a和圖2-b可知，隨著山梨糖醇質(zhì)量濃度的升高，明膠的儲能模量G′呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在糖醇添加量為50 g/L時達到最大，且均高于對照組。說明糖醇的加入促使明膠-水-多元醇三元復合體系形成，明膠網(wǎng)絡間的纏結(jié)點增多，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)固[10]，因此儲能模量增大。而過高濃度的糖醇“占用”了更多的水，一定程度上破壞了三元體系的平衡，降低了體系的彈性，故而模量有所下降。

圖2 溫度對含有不同濃度山梨糖醇的明膠G′和G″的影響Fig.2 The effect of temperature on G′ and G″ of gelatin containing sorbitol at different concentrations

損耗模量G″的變化趨勢與G′不同，隨著山梨糖醇濃度升高，G″持續(xù)增大，說明隨著山梨糖醇的加入體系黏度增加。這可能是因為山梨糖醇分子含有多個氫鍵，在體系中山梨糖醇-明膠-水復合體系充分形成后，過量的山梨糖醇中的羥基依舊可以與體系中的山梨糖醇分子的羥基通過氫鍵結(jié)合，增加了體系中的分子鏈的長度，造成體系中黏度的進一步上升[22]。

由表1可知，隨著山梨糖醇質(zhì)量濃度的增加，明膠體系在較高溫度下膠凝能力顯著提升(P<0.05)。

表1 含有不同質(zhì)量濃度山梨糖醇明膠的熔化/膠凝溫度Table 1 Melting and gelation temperature of gelatin containing sorbitol at different concentrations

注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。

這可能說明明膠-山梨糖醇-水三維體系的形成有利于增加凝膠的熱穩(wěn)定性，因此在夏季環(huán)境中，山梨糖醇的添加更有利于明膠食品體系凝膠狀態(tài)的保持。KUAN等[4]在66.7 g/L的鴨足明膠中加入質(zhì)量濃度0、50、100、200、400 g/L的蔗糖和乳糖，結(jié)果表明明膠的膠凝和熔化溫度隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而持續(xù)升高，與本研究相一致。

2.2.2 頻率掃描

頻率掃描主要研究物質(zhì)對高頻或低頻的響應性，將其應用于食品領(lǐng)域中，可為反應食品口感提供理論數(shù)據(jù)。圖3反映了各樣品的儲能模量和損耗模量隨頻率變化的規(guī)律。

圖3 頻率對含有不同濃度山梨糖醇明膠G′和G″的影響Fig.3 The effect of frequency on G′ and G″ of gelatin containing sorbitol at different concentrations

各樣品的儲能模量G′隨頻率升高變化不大，彈性在0～100 Hz基本不受頻率影響，均形成了穩(wěn)定的凝膠體。損耗模量G″隨著頻率的增大呈上升趨勢，說明黏性受頻率影響變化較大。50 g/L山梨糖醇組有最高的儲能模量，損耗模量則隨著山梨糖醇濃度升高而增大，與溫度掃描的規(guī)律相同。

2.3 差示掃描量熱分析

表2中的數(shù)據(jù)顯示，山梨糖醇添加量達50 g/L，凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度顯著提高(P<0.05)，較高的轉(zhuǎn)變溫度說明凝膠體系的熱穩(wěn)定性更強。更高的熱焓值表明更穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，氫鍵相互作用加強，無規(guī)則卷曲減少，凝膠強度增大[23]，添加山梨糖醇后，熱焓值ΔH顯著增大(P<0.05)，并于添加量為50 g/L時達到最大，與凝膠強度的變化規(guī)律相符。

表2 含有不同質(zhì)量濃度山梨糖醇明膠的 凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度和熱焓值Table 2 Gel-sol temperature and ΔH of gelatin containing sorbitol at different concentrations

注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2.4 紅外光譜

由表3和圖4可知，位于3 454 cm-1附近的特征峰表示為N—H振動，當N—H基團參與形成氫鍵時，其峰位向低波數(shù)移動，當糖醇添加量小于50 g/L時，其峰位移向低波數(shù)，表明體系中更多的N—H基團參與氫鍵的形成[24]，這主要是因為山梨糖醇中帶有大量羥基，可與明膠中肽鍵的N—H基團形成氫鍵。但當山梨糖醇濃度大于50 g/L時，隨著其質(zhì)量濃度繼續(xù)增加峰位變化不明顯，這可能是因為暴露的N—H基團已經(jīng)被占據(jù)，無法再形成更多的氫鍵。位于3 658 cm-1附近的酰胺A帶表示成氫鍵的—OH振動，隨著山梨糖醇的添加，其沒有明顯的位移，說明體系中與—OH有關(guān)的氫鍵沒有明顯變化，這可能是因為山梨糖醇添加后，盡管其羥基與明膠中的氨基形成了氫鍵，但體系中原本明膠分子內(nèi)部羥基與其他基團所形成的的氫鍵可能被破壞，使體系中參與氫鍵形成的羥基數(shù)量總體平衡。也就是說山梨糖醇的加入可能致使明膠分子之間形成的氫鍵被破壞。

圖4 含有不同質(zhì)量濃度山梨糖醇明膠的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of gelatin containing sorbitol at different concentrations

表3 含有不同濃度山梨糖醇明膠的酰胺帶吸收峰位置Table 3 The absorbance positions of gelatin containing sorbitol at different concentrations

注：“-”表示未檢出。

2.5 圓二色譜分析

研究表明[27-28]，明膠通常在197 nm附近有明顯的負峰，225 nm附近有明顯的正峰，這2個峰均與α-螺旋和三螺旋構(gòu)象的存在有關(guān)。由圖5和表4可知，所有的樣品均在203 nm和223 nm處分別有明顯的負峰和正峰，山梨糖醇的加入并未使明膠的出峰位置發(fā)生偏移，說明蛋白的天然構(gòu)象未發(fā)生改變。223 nm處正峰表示明膠在稀溶液中具有恢復三螺旋結(jié)構(gòu)的能力，糖醇添加量為50 g/L時達到最大，表明適當濃度的山梨糖醇使明膠分子鏈間交聯(lián)點增加，恢復三螺旋結(jié)構(gòu)的能力增強。隨著山梨糖醇質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，溶液中明膠恢復三螺旋結(jié)構(gòu)的能力明顯減弱，原因可能在于高濃度山梨糖醇“搶奪”明膠分子表面水分所致。

小寫字母a-e從上到下依次代表山梨糖醇質(zhì)量濃度50、100、30、200、0 g/L圖5 含有不同質(zhì)量濃度山梨糖醇明膠的圓二色譜圖(A)和局部放大圖(B)Fig.5 CD spectra of gelatin containing sorbitol at different concentrations

表4 含有不同質(zhì)量濃度山梨糖醇明膠的圓二色譜數(shù)據(jù)Table 4 CD data of gelatin containing sorbitol at different concentrations

山梨糖醇質(zhì)量濃度/(g·L-1)正吸收峰波長/nm正吸收峰值/(deg·cm2·dmol-1)負吸收峰波長/nm負吸收峰值(deg·cm2·dmol-1)02231.41±0.03e203-15.63±0.07e302231.72±0.06c203-17.55±0.05b502231.93±0.08a203-17.05±0.06d1002231.85±0.03b203-17.71±0.09a2002231.54±0.06d203-17.36±0.06c

注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

本實驗測定了不同質(zhì)量濃度山梨糖醇對兔皮明膠理化特性的影響，研究結(jié)果表明：

(1)添加山梨糖醇能使凝膠強度顯著增大，并于添加量為50 g/L時達到最大值，繼續(xù)增大山梨糖醇的質(zhì)量濃度強度有所下降，但均高于對照組。

(2)流變學結(jié)果顯示，山梨糖醇的添加可以增加體系的儲能模量，添加量為50 g/L時儲能模量達到最大值，與凝膠強度變化規(guī)律相同；而損耗模量隨山梨糖醇質(zhì)量濃度的升高而增大，表明山梨糖醇的添加增大了體系的黏性。流變學和差式掃描量熱分析結(jié)果均顯示添加山梨糖醇使明膠的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度升高，使凝膠具有更好的熱穩(wěn)定性。

(3)結(jié)構(gòu)分析表明，山梨糖醇主要通過氫鍵產(chǎn)生相互作用，山梨糖醇的增加會導致原有的明膠分子間或分子內(nèi)氫鍵被破壞；當山梨糖醇質(zhì)量濃度小于50 g/L時，其添加有利于明膠在溶液中三螺旋結(jié)構(gòu)的恢復，但添加質(zhì)量濃度超過50 g/L時，三螺旋結(jié)構(gòu)恢復能力明顯減弱，原因可能在于高濃度山梨糖醇“搶奪”明膠分子表面水分所致。