陳其福 劉 暢 斯琴圖雅 趙弘韜 劉大軍 馮國軍*

（1黑龍江大學農(nóng)作物研究院，黑龍江哈爾濱 150080；2黑龍江省科學院技術物理研究所，黑龍江哈爾濱 150010）

誘變對基因組成的損傷和改變，涉及大量潛在靶向性狀基因的突變，是生物學中鑒定基因功能的基本方法。通過物理、化學或生物手段誘導作物發(fā)生突變，增加可利用的基因組變異，是獲得所需農(nóng)藝性狀的有效和低成本的手段（Talukdar，2014）。近年來，已經(jīng)在菜豆（Porch et al.，2009；郭寧 等，2018）、大豆（Hwang et al.，2015）、綠豆（Singh et al.，2000；Wani et al.，2017）、 豌 豆（Sharma et al.，2015）、扁豆（Ali et al.，2010）、鷹嘴豆（Barshile et al.，2009）等主要豆科作物中開發(fā)穩(wěn)定的突變種群和構建飽和連鎖圖譜方面取得了很大進展，極大地促進了豆科作物的改良和功能基因組研究。突變體是研究植物遺傳、育種、基因定位和基因鑒定的理想材料，植物的光合作用（Chua & Bennoun，1975；Mullineaux，1994）及一些代謝途徑（Zhang et al.，2010；Beckers et al.，2016）的基礎理論研究大都是利用突變材料作為試材而展開的。

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）是一種重要的蔬菜作物，因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富而深受廣大人民的喜愛。菜豆存在豐富的植物學和農(nóng)業(yè)生物學性狀的變異。菜豆是自花授粉作物，花為蝶形兩性完全花，具有閉花自花授粉的習性。由于花器官的結構特殊，菜豆雜交授粉難度大，因此利用誘變獲得生物遺傳變異對于菜豆新品種選育尤為重要。在IAEA突變品種數(shù)據(jù)庫（https：//mvd.iaea.org/）記錄的突變品種中，有多個利用人工誘變獲得的突變材料選育的抗葉斑病和金色花葉病毒病的菜豆品種。本試驗通過不同劑量的60Co-γ射線輻照菜豆干種子，篩選半致死劑量，為輻射育種技術研究提供參考。構建的突變體庫包含多種突變類型，可以為菜豆品種改良和基礎研究提供新的材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為黑龍江大學農(nóng)作物研究院提供的矮生菜豆品種A18-1的干種子。該品種的生長習性為有限生長類型，早熟，植株莖表皮和葉脈為淺綠色，花為粉白色，莢為圓棍形、略彎曲，平均莢長15 cm，綠色的幼莢表皮在成熟過程中逐漸轉變?yōu)辄S色，熟期為50～55 d。

1.2 半致死劑量篩選

選擇均勻飽滿的菜豆品種A18-1的干種子6份，每份100粒，用輻射強度為0.1 Gy·min-1的60Co-γ射線處理，處理時間分別為0、500、1 000、1 500、2 000、2 500 min，輻射劑量分別為 0、50、100、150、200、250 Gy。將輻射處理后的種子用穴盤單粒播種，發(fā)芽后逐日記錄種子發(fā)芽數(shù)、出苗數(shù)（以初生真葉展開為標準）、苗成活數(shù)，直至不再有新的種子發(fā)芽，并記錄最終成苗數(shù)。

發(fā)芽率=最終發(fā)芽數(shù)/播種總粒數(shù)

相對發(fā)芽率=（處理后種子的實際發(fā)芽率/對照種子發(fā)芽率）×100%

同理計算不同處理的相對出苗率。用Microsoft Excel軟件分析輻射劑量與相對出苗率的線性關系，以輻射劑量為橫坐標，相對出苗率為縱坐標建立輻射劑量與相對出苗率的線性回歸方程。根據(jù)回歸方程，計算相對出苗率為50%時的輻射劑量為半致死劑量。

1.3 誘變處理

選擇矮生菜豆品種A18-1的種子2 500粒，在黑龍江省科學院技術物理研究所進行60Co-γ輻射處理，輻射強度為0.1 Gy·min-1，輻射劑量為126 Gy。輻射處理后的M1種子于2017年11月在海南播種，最終收獲種子的單株共826株，占處理種子總數(shù)的33%。

1.4 M2突變體庫表型篩選

M2于2018年5月21日在黑龍江大學呼蘭實驗基地播種。共收集786份M2種子，其中20粒種子以上的材料單行單粒播種20株，其余全部單粒播種，總共播種15 600株M2單株。從出苗后開始觀察植株表型的變化，包括葉、莖、熟期、育性、莢和株型等性狀，并對每一株突變單株進行編號和表型描述，便于后期采收整理和記錄。莢完全成熟后，單獨采收每一株突變株的種子；對于無法獲得種子的突變株，采收所在株系的其余單株的種子。

2 結果與分析

2.1 半致死劑量篩選

對發(fā)芽率的統(tǒng)計結果表明，不同輻射劑量處理的發(fā)芽率雖然都低于對照，但不同處理間的相對發(fā)芽率變化不大（表1）。輻射處理對M1種子的致死效應在種子發(fā)育過程中逐漸顯現(xiàn)。低劑量處理的發(fā)芽率與出苗率相當，隨著輻射劑量的增加，出苗率明顯低于發(fā)芽率，因此計算半致死劑量時以出苗率為計量標準。對出苗率的統(tǒng)計結果顯示，相對出苗率隨著輻射劑量增加而明顯降低（表1）。根據(jù)輻射劑量與相對出苗率的線性回歸方程y=-0.003x+0.916（圖1），相對出苗率為50%時的輻射劑量為126 Gy，即為半致死劑量。

表1 60Co-γ射線處理干種子的相對發(fā)芽率和相對出苗率

圖1 輻射劑量與相對出苗率的線性關系

2.2 M2表型觀察

對M2的田間表型進行鑒定，共發(fā)現(xiàn)279株突變株（表2），將突變體按突變性狀分為生長習性和株型突變、熟期突變、黃化突變、莖突變、葉突變、莢突變、花和育性突變7種類型，總突變率為1.83%。因為花和育性突變直接相關，故將兩類突變一起統(tǒng)計。株型性狀較為復雜，由多個相關性狀組成，在統(tǒng)計的突變性狀中突變率最高。

表2 M2表型突變統(tǒng)計及描述

2.2.1 生長習性和株型突變 誘變材料A18-1為有限生長習性的菜豆品種。在A18-1突變體庫中觀察到3株無限生長習性的突變體1-13-1、23-14-1和20-25-1，其中1-13-1和23-14-1表型相同，表現(xiàn)為開花時間延遲，花器官結構畸形，總狀花序表現(xiàn)為無限型，花序軸頂端小花先開放，側生小花開花延遲或停止發(fā)育（圖2-a、2-b）。因其無法完成正常的授粉過程，而沒有收獲種子。20-25-1表現(xiàn)為葉脈紫紅色（A18-1為淺綠色），長勢弱，莢變寬、表皮出現(xiàn)紅暈（圖2-c、2-d）。

株型是由多基因控制的質量性狀，與菜豆的產(chǎn)量性狀直接相關。突變體庫中株型突變最為豐富，包括分枝數(shù)減少、直立性增強、株高變矮等類型。突變體8-28-1、8-28-2和8-28-3在同一株系，表現(xiàn)出株高變矮、葉片卷曲的變異（圖3-a）。而另一株系的5-5-1和5-5-2突變株則表現(xiàn)為分枝數(shù)減少（圖 3-b）。

圖2 生長習性突變

圖3 株型突變

2.2.2 熟期突變 在突變體鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)單行4株表現(xiàn)早熟的突變體（編號5-13-1、5-13-2、5-13-3和5-13-4），約占該株系的1/4，推測該突變?yōu)閱位蛲蛔儭Ｇv色持綠突變株10-7-1和紫花突變株5-22-1也表現(xiàn)為熟期略微提前。因為菜豆品種A18-1為早熟品種，所以熟期突變多表現(xiàn)為熟期延遲，在突變體庫中共發(fā)現(xiàn)51株熟期明顯延遲的突變株，部分單株的熟期甚至比對照平均熟期延遲30 d以上。

2.2.3 花和育性突變 菜豆A18-1的花為粉白色（圖4-c），突變體中出現(xiàn)顏色加深的突變株，其中突變株10-6-1的花瓣出現(xiàn)深色的斑塊（圖4-a），突變株20-25-1的花瓣則變?yōu)樽霞t色（圖4-b）。突變體庫中還出現(xiàn)了花器官結構畸形（圖4-d、4-e、4-f），如柱頭外露影響胚珠受精而導致的育性降低。如16-2-1突變株的花序軸縮短，花瓣細長導致雌蕊和雄蕊暴露（圖4-f）。在觀察過程中還發(fā)現(xiàn)一類出現(xiàn)頻率很高的獨特敗育表型，表現(xiàn)為開花時間延遲、花期長、花蕾后期未正常開放，葉色深綠、略微卷曲，莢變小、胚珠不膨大，無法形成正常的種子（圖4-g、4-h）。有個別植株形成少量成熟的種子，推測該突變?yōu)樾坌圆挥蛔儯倭空０l(fā)育的種子則可能由環(huán)境中昆蟲傳播花粉完成授粉（圖4-i）。

2.2.4 莖突變 在突變體庫中發(fā)現(xiàn)的莖突變較少，其中12-12-1和2-11-1突變株表現(xiàn)為莖和葉柄變細（圖5-a），分別在不同的單行發(fā)現(xiàn)。此外，發(fā)現(xiàn)3株莖變粗的突變株26-9-1、26-9-2和15-21-1，其中26-9-1、26-9-2還表現(xiàn)出葉形的變異（圖5-b、5-c）。2株莖顏色突變株5-22-1和20-25-1均表現(xiàn)為莖由綠色突變?yōu)樽仙?，與其他表型的變異同時出現(xiàn)。

圖4 花和育性突變

圖5 莖突變

2.2.5 葉突變 在突變體庫中鑒定出多株葉形和葉色突變，其中5-14-1突變株表現(xiàn)為葉片變厚，葉片靠近葉柄基部的部分變窄（圖6-a），且全株長勢弱，開花晚、花瓣細長，花開放數(shù)天后凋謝，未能結莢。突變株26-9-1和26-9-2在同一單行發(fā)現(xiàn)，都表現(xiàn)為葉面積變大，葉由卵圓形變?yōu)榻鼒A形（圖6-b），該突變體除葉形突變外還表現(xiàn)出莖變粗，開花晚等其他性狀的變異。突變株16-2-1葉片變小，三出復葉的小葉有2條主葉脈，形成2個細長的葉尖（圖6-c），這一突變株還表現(xiàn)出花結構異常（圖4-f）。

圖6 葉突變

葉色變異表現(xiàn)為葉片黃化、葉脈突變?yōu)樽霞t色、葉片灰綠色。頻率最高的為葉片黃化（圖6-d），占突變總數(shù)的15%。將黃化突變體按照黃化持續(xù)時間分為持續(xù)黃化和后期轉綠兩類，持續(xù)黃化的突變株整體表現(xiàn)出植株矮小、長勢弱、開花結莢少；而后期轉綠的突變株在轉綠后與對照植株相比無明顯變異。葉色突變體中12-3-1、12-3-2和26-9-3為葉片灰綠色突變體（圖6-e），其中12-3-1和12-3-2在同一單行。

此外，本試驗還在同一單行發(fā)現(xiàn)4株獨特的無葉片分化的突變株（21-20-1/-2/-3/-4），在營養(yǎng)生長階段，植株正常長出2片初生真葉，出現(xiàn)多個分枝，但沒有正常的葉片分化（圖7-a）。在生殖生長階段，分化出許多結構異常的小花，表現(xiàn)為花瓣變小、柱頭外露（圖7-b）。

2.2.6 莢突變 莢突變包括莢色和莢形突變。紫化突變株5-22-1的莢表面產(chǎn)生紫紅色的條紋（圖8-a），而突變株10-7-1的成熟莢由黃色突變?yōu)榫G色，并且莢形也由圓棍形突變?yōu)閷挶庑危▓D8-b）。突變株11-6-1的莢變小，胚珠不膨大（圖8-c）；突變株20-6-1則表現(xiàn)為莢變小、彎曲，結少量種子（圖8-d）。

圖7 無三出復葉分化突變體21-20-1

圖8 莢突變

2.2.7 多種表型同時突變 植物的生長發(fā)育和器官的形態(tài)建成是一個復雜的網(wǎng)絡調控過程，一種結構或生理的變化，也會對其他結構器官和生理性狀產(chǎn)生影響，一些發(fā)育調控基因的突變往往引起多種表型的變化（Mizukami & Fischer，2000；王利，2016）。在突變體觀察過程中，發(fā)現(xiàn)多種性狀往往同時發(fā)生改變。例如5-14-1和16-2-1葉形變化的突變體，其花的結構也發(fā)生明顯的變異。黃化突變體2-2-1，植株矮小，花的柱頭明顯外露，無法正常完成授粉受精，導致其敗育。5-22-1紫化突變體除了表現(xiàn)出莖、葉、花、莢的紫化變異，還表現(xiàn)出莢熟期提前的變異。10-7-1莢色持綠突變株則同時表現(xiàn)出莢形變寬和熟期提前的變異。

3 結論與討論

研究表明，植物在面臨干旱、低溫和高光脅迫時，花青素含量顯著增加（宋明 等，2012；Ilk et al.，2015），表明花青素在響應逆境脅迫中發(fā)揮重要的作用。本試驗發(fā)現(xiàn)的5-22-1紫化突變株的下胚軸、莖、葉、花和莢表皮均表現(xiàn)出紫色色素積累變異，將有望在干旱和低溫抗性品種的選育中發(fā)揮作用。

菜豆葉形和葉色突變對于研究葉形態(tài)發(fā)育和色素積累具有重要的促進作用。在模式植物擬南芥的快中子誘變和EMS誘變體篩選中也發(fā)現(xiàn)了葉片灰綠突變體（朱勇，2005；曹雅君，2006）。在其他植物葉形突變體的研究中，已經(jīng)鑒定了多個與葉形相關的基因，如擬南芥中菜素內(nèi)酯信號途徑相關基因BRH1調節(jié)葉片的生長發(fā)育并影響葉片的形態(tài)（Wang et al.，2018），番茄中的生長素轉錄因子SlIAA9/ENTIRE/E調控葉片的形態(tài)和果實發(fā)育（Wu et al.，2018），豌豆中AF和UNI基因影響葉片中生長素含量和分布，進而影響豌豆的葉片形態(tài)（Darleen et al.，2013）。在突變體庫中，葉形的突變往往與花的結構異常同時出現(xiàn)。在觀察到的多個葉形與葉色突變體中，花的結構都發(fā)生了一定程度上的變異，甚至直接導致花敗育。這可能與葉片和花在形態(tài)發(fā)生上的同源性有關，雖然花在形態(tài)和功能上與葉差異很大，但在形態(tài)發(fā)生、生長方式和維管系統(tǒng)等方面與葉相似（張愛芹 等，2006）。已有研究證明菜豆生長習性是由PvTFL1y基因控制的質量性狀（Repinski et al.，2012），無限生長習性相對于有限生長習性為顯性，在擬南芥（Shannon & Meeks-Wagner，1991）、芝麻（Zhang et al.，2018）、木豆（Mir et al.，2014）和大豆（Liu et al.，2010）等多種植物中也發(fā)現(xiàn)相同功能的同源基因。本試驗在有限生長習性的A18-1菜豆突變體庫中觀察到無限生長型的突變株，這一突變類型的出現(xiàn)，與Repinski等（2012）描述的菜豆生長習性的遺傳模式不符，因此推測菜豆中應該還存在除PvTFL1y之外的控制生長習性的非同源基因。特定生理性狀的變異，對于改良作物的品質性狀和植株抗性方面具有重要的應用價值。本試驗建立的突變體庫是基于田間表型觀察，而生理性狀的突變則無法通過表型觀察進行鑒別。為了進一步表征突變體的變異特征，下一步將對突變體的生理生化指標進行測定，明確不同表型變異的生理機制。

本試驗利用126 Gy60Co-γ射線輻射處理菜豆的干種子，在M2鑒定了包括葉、花、莖、熟期、株型和育性在內(nèi)的多種突變類型，為菜豆種質資源創(chuàng)新提供新材料。同時，重要性狀的突變，如紫化、莢色和葉形的突變，為研究對應性狀的遺傳和分子機理提供了試驗材料。構建菜豆突變體庫，可以從突變體庫中選擇重要農(nóng)藝性狀突變株系用于雜交育種。