趙文宗 鄭旭陽 張映卿 鐘 川 陽燕娟 于文進(jìn)

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004）

青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，以下簡稱青枯病菌）引起的一種土傳性維管束病害，常造成茄科作物的大面積萎蔫死亡。由于青枯病菌特有的生活習(xí)性和傳播特性，使用常規(guī)的化學(xué)藥劑難以防治，給番茄生產(chǎn)造成了極大的威脅（肖燁 等，2007；Tan et al.，2011）。采用抗病砧木嫁接技術(shù)來防控青枯病是當(dāng)前最經(jīng)濟、有效的手段，可顯著降低茄科作物的田間發(fā)病率，提高其抗病能力（張紅浩 等，2015；趙曾菁等，2016；王岳霞 等，2018）。前人的研究表明，當(dāng)植物根系受到病原菌侵染時，根部次生代謝物質(zhì)的合成增加可以防御病原菌的侵襲（周寶利 等，2011）。根系分泌物是植物根部最主要的次生代謝產(chǎn)物，能夠?qū)ν寥牢⑸铮òú≡┖椭参锂a(chǎn)生有益或有害的影響，與植物的抗病性密切相關(guān)（Yang et al.，2014）。

前人分別對黃瓜（韓雪 等，2006）、辣椒（耿廣東 等，2009）、西瓜（郭尚 等，2010）、茄子（周寶利 等，2011）和大蔥（徐寧 等，2012）等多種蔬菜的根系分泌物進(jìn)行了研究，并分析了其中的化感成分。但嫁接番茄根系分泌物與抗青枯病的關(guān)系及其組分分析目前鮮有報道。因此，本試驗采用水培的方法分別收集了砧木、自根番茄和嫁接番茄的根系分泌物，探討了根系分泌物對青枯病及其病原菌的抑制作用以及對番茄幼苗生長的影響，旨在為番茄青枯病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

接穗與砧木：供試品種均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院育成和提供。接穗為高感青枯病的櫻桃番茄粉貝貝（Solanum lycopersicumvar.cerasiformecv.‘Fb’，以下統(tǒng)稱自根番茄），砧木分別為高抗青枯病的番茄專用砧木番砧1號（Solanum lycopersicumcv.‘No.1’，簡稱番砧）和番茄、茄子通用砧木茄砧21號（Solanum melongenacv.‘No.21’，簡稱茄砧）。

青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum）：從田間番茄青枯病發(fā)病植株上分離并進(jìn)行純化和保存，經(jīng)鑒定具有較強致病力的青枯病菌作為接種用病原菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗于2018年7～9月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜基地和人工氣候室中進(jìn)行。試驗共設(shè)置5個處理，分別為接穗、砧木的自根苗（粉貝貝、番砧和茄砧）和砧穗嫁接苗（粉貝貝/番砧和粉貝貝/茄砧）。供試砧木用50孔穴盤播種，接穗用72孔穴盤播種，育苗基質(zhì)按泥炭∶椰糠∶珍珠巖= 2∶1∶1的體積比配制（下同）。當(dāng)砧木長至三葉一心時采用C型套管貼接法嫁接。嫁接成活后移苗至營養(yǎng)缽（80 mm×65 mm）中培養(yǎng)，待幼苗長至4～5片真葉時移至人工氣候室中，設(shè)置室內(nèi)光源光期16 h/暗期8 h，溫度26 ℃/20 ℃（晝/夜），相對濕度60%～80%，統(tǒng)一進(jìn)行水肥管理。取健壯幼苗培養(yǎng)至現(xiàn)蕾期，用于收集根系分泌物，每處理30株，3次重復(fù)，以滅菌去離子水作為對照（CK）。

1.2.2 根系分泌物的收集 參照楊國棟（2016）的方法并進(jìn)行改進(jìn)，各處理分別取長勢基本一致的幼苗10株，將幼苗小心地從營養(yǎng)缽中取出，盡量避免傷根，分別用清水和去離子水充分洗去根上附著的基質(zhì)。采用水培的方法收集根系分泌物，將10株幼苗一同栽培于裝有500 mL去離子水的不透光惰性塑料小桶中，連續(xù)通氣10 h培養(yǎng)后即得植株的根系分泌物粗收集液，重復(fù)3次，合并收集液，經(jīng)定容、過濾后，統(tǒng)一用去離子水調(diào)整成相同濃度0.05 g·mL-1，保存于4 ℃條件下備用。

1.2.3 根系分泌物對青枯病菌的抑制作用 根系分泌物收集液經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后，與2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培養(yǎng)基按1∶9的體積比制成混合培養(yǎng)基，以添加無菌水為對照。取0.1 mL經(jīng)梯度稀釋的青枯病菌菌液（濃度1×10-4CFU·mL-1）均勻涂布于混合培養(yǎng)基上，每處理3次重復(fù)，48 h后統(tǒng)計各皿菌落數(shù)，并計算相對抑菌率。

相對抑菌率=（對照皿菌落數(shù)-處理皿菌落數(shù)）/對照皿菌落數(shù)×100%

1.2.4 根系分泌物對青枯病和番茄幼苗生長的影響以高感青枯病番茄品種粉貝貝為試材，在72孔穴盤中播種育苗，待幼苗三葉一心后轉(zhuǎn)至營養(yǎng)缽中培養(yǎng)。緩苗7 d后，用上述5個處理的根系分泌物進(jìn)行灌根處理，每處理60株，每株20 mL，每隔3 d灌根1次，連續(xù)進(jìn)行3次。灌根結(jié)束7 d后，將幼苗分為兩部分，一部分用于接種試驗，每處理30株，3次重復(fù)，采用傷根灌注法接種青枯病菌（濃度 5×108CFU·mL-1），每缽灌入菌液 15 mL；另一部分不接種，用于番茄幼苗生長試驗，每處理選取長勢一致的幼苗10株，測定其株高、莖粗、干鮮質(zhì)量等指標(biāo)，并求平均值。株高、莖粗和干鮮質(zhì)量分別用直尺、游標(biāo)卡尺和精密電子天平測定。

1.2.5 發(fā)病情況調(diào)查 接種病原菌后，每隔5 d調(diào)查1次植株的發(fā)病情況，共觀察30 d。參照謝丙炎等（2010）的方法，根據(jù)植株發(fā)病情況將病情級別分為5級。0級：無癥狀；1級：1片葉萎蔫；2級：2～3片葉萎蔫；3級：除植株頂部2～3片葉外，其他葉片均萎蔫；4級：全株葉片萎蔫，植株死亡。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/接種總株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=∑（病情級別×該病級株數(shù)）/（病情最高級別×接種總株數(shù)）×100

1.2.6 根系分泌物的GC-MS分析 參照周寶利等（2011）的方法并進(jìn)行改進(jìn)，用乙酸乙酯對各處理的根系分泌物收集液按等體積進(jìn)行萃取，連續(xù)萃取3次，合并有機相，經(jīng)無水Na2SO4干燥后過濾，于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，并用對應(yīng)有機溶劑復(fù)溶，樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后保存于4 ℃條件下備用。利用GC-MS（Agilent 7890A-5975C）對根系分泌物的組分進(jìn)行分析。根據(jù)總離子流圖，通過檢索對比譜圖庫NIST08分析各組分中所含物質(zhì)，并采用峰面積歸一法確定各物質(zhì)的相對含量。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為 99.99% 的 He，流量 1 mL·min-1。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，基礎(chǔ)柱溫50 ℃，保持2 min，然后以6 ℃·min-1程序升溫至250 ℃，保持15 min。進(jìn)樣量1 μL，不分流。質(zhì)譜條件：利用電子轟擊源（EI），設(shè)置轟擊電壓70 eV，離子源溫度為230 ℃。采用全掃描模式，掃描范圍M/Z 30～600 amu，掃描速度每點0.2 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同根系分泌物對青枯病菌的抑制作用

砧木和嫁接番茄的根系分泌物均能對青枯病菌的增殖產(chǎn)生較好的抑制作用（圖1）。不同處理間存在差異，其中抑菌效果最好的是粉貝貝/茄砧處理，相對抑菌率為13.36%；其次是粉貝貝/番砧和茄砧處理，均為10.53%；番砧處理最低，為7.69%。粉貝貝處理對青枯病菌的生長表現(xiàn)為促進(jìn)作用，抑菌率為-10.32%，顯著低于其他處理。

2.2 不同根系分泌物對番茄青枯病抗性的影響

由表1可知，施加粉貝貝的根系分泌物后，番茄青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)均與無菌水對照差異不顯著。番砧和茄砧的根系分泌物對青枯病具有較好的抗病效果，發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照。粉貝貝/番砧和粉貝貝/茄砧的根系分泌物對青枯病也有較好的抗病效果，發(fā)病率和病情指數(shù)均明顯低于對照，但高于相應(yīng)砧木。

表1 不同處理的根系分泌物對番茄青枯病抗性的影響

2.3 不同根系分泌物對番茄幼苗生長的影響

砧木、自根番茄和嫁接番茄的根系分泌物對番茄幼苗的生長存在不同的影響（表2）。砧木和嫁接番茄整體表現(xiàn)為促進(jìn)作用；而自根番茄除對株高有一定的促進(jìn)作用外，對其他指標(biāo)影響不顯著。其中，粉貝貝/番砧處理顯著提高了番茄的株高，較對照增加了32.3%，其次為番砧處理，較對照顯著提高了29.2%。番砧處理對番茄的莖粗促進(jìn)效果最好，較對照顯著增加了8.4%，其次是粉貝貝/番砧，較對照增加了6.8%。番砧和粉貝貝/番砧處理的根系分泌物對番茄地上部和地下部鮮質(zhì)量均表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，優(yōu)于茄砧和粉貝貝/茄砧處理。砧木和嫁接番茄對幼苗地上部和地下部干質(zhì)量的影響不大。

表2 不同處理的根系分泌物對番茄幼苗生長的影響

2.4 不同處理根系分泌物的GC-MS分析

對自根番茄、砧木和嫁接番茄根系分泌物的乙酸乙酯組分進(jìn)行分析（表3）。結(jié)果表明，該組分首次出峰時間在13 min左右，最后出峰時間在40 min左右，集中出峰時間為18～35 min。從根系分泌物中分離出烴類、酚類、酯類、醇類、醌類和酮類物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)為主要成分，占比65.03%～85.42%，其次為烴類，占比10.38%～27.89%。相對含量較高的是1-十二烯、月桂烷、1-十四烯、十四烷、2，4二叔丁基苯酚、1-十六烯、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二（2-乙基己）酯、鄰苯二甲酸二異辛酯等物質(zhì)。不同處理間根系分泌物的組分存在差異，其中1-十八烯僅在粉貝貝中檢出，2，6-二叔丁基苯醌則僅在嫁接番茄中檢出，2，4-二叔丁基苯酚則在嫁接番茄中含量較高。與自根番茄相比，采用番砧和茄砧嫁接后，烴類物質(zhì)相對含量分別降低了7.31%和3.27%。鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二異辛酯等物質(zhì)在抗病砧木自根植株和嫁接植株根系分泌物中的相對含量明顯高于感病接穗自根植株，因此這些物質(zhì)可能與嫁接誘導(dǎo)番茄抗青枯病有關(guān)。

表3 不同處理根系分泌物的組分分析

3 結(jié)論與討論

根系分泌物是土壤中化感物質(zhì)的重要來源，通過對植株、根際微生物包括病原菌的化感作用來調(diào)節(jié)病害的發(fā)生和發(fā)展（周寶利 等，2011）。不同種類或基因型品種的植物，其根系分泌物的組成和含量差異很大，同時與植物對土傳病害的抗性密切相關(guān)（Strehmel et al.，2014；Zhang et al.，2014；Luo et al.，2015）。徐寧等（2012）認(rèn)為大蔥根系分泌物中含有酯類、酰胺類、酸類等物質(zhì)，對枯萎病菌菌絲生長存在抑制作用，對黃瓜種子的萌發(fā)也存在一定的促進(jìn)作用。本試驗中，砧木和嫁接番茄的根系分泌物對青枯病菌的增殖均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，其中抑菌效果最好的是茄砧嫁接番茄，其次是茄砧和番砧嫁接番茄。番砧和茄砧的根系分泌物對青枯病具有較好的抗病效果，青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照。嫁接番茄的根系分泌物對青枯病也有較好的抗病效果，病情指數(shù)均顯著低于對照，但高于相應(yīng)砧木。2個供試砧木和嫁接番茄的根系分泌物對青枯病菌的抑制效果和對青枯病的抗性存在不一致的情況，可能是由于本試驗中的根系分泌物為粗提物，其抑菌活性物質(zhì)含量不同；砧穗互作也可能對結(jié)果產(chǎn)生了一定的影響，這一點仍需進(jìn)一步驗證。

砧木、自根番茄和嫁接番茄的根系分泌物對番茄幼苗的生長存在不同的影響，其中番砧和番砧嫁接番茄對幼苗株高和莖粗產(chǎn)生了明顯的促進(jìn)作用。供試砧木和嫁接番茄的根系分泌物有利于幼苗地上部和地下部鮮質(zhì)量的提高，其中番砧和番砧嫁接番茄的效果較好，而自根番茄的根系分泌物則對幼苗的生長影響不顯著。由此說明，砧木和嫁接番茄的根系分泌物改善了番茄幼苗對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，對其生長有較好的促進(jìn)作用。

目前，對植物源活性物質(zhì)的研究已成為熱點和趨勢，并取得了較大的進(jìn)展（張興 等，2015）。通過對根系分泌物乙酸乙酯組分進(jìn)行GC-MS分析，檢測到了烴類、酚類、酯類、醇類、醌類和酮類物質(zhì)，酯類物質(zhì)為主要成分。自根番茄和嫁接番茄根系分泌物的物質(zhì)成分存在一定差異，嫁接番茄中烴類物質(zhì)的相對含量要低于自根番茄，而2，6-二叔丁基苯醌僅在嫁接番茄的根系分泌物中檢出。鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二異辛酯在砧木和嫁接番茄根系分泌物中的相對含量明顯高于自根番茄，2，4-二叔丁基苯酚在嫁接番茄的根系分泌物中含量較高。有研究表明，鄰苯二甲酸等衍生物廣泛存在于根系分泌物中，這些物質(zhì)普遍對植物有化感效應(yīng)，同時對土傳性病原菌有一定的抑制作用（Xuan et al.，2006；周寶利 等，2010）。酚類物質(zhì)則是較為常見的化感自毒物質(zhì)。陳君良（2016）從百合的根系分泌物中檢測到了鄰苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚等具有化感活性的物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)它們均對蘿卜種子的萌發(fā)有抑制作用。段曦等（2017）通過GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)嫁接辣椒根系分泌物中含有鄰苯二甲酸二異辛酯，能夠抑制根腐病菌和青枯病菌的增殖。因此，推測這些物質(zhì)可能是對番茄青枯病菌產(chǎn)生抑制作用的關(guān)鍵活性物質(zhì)，而其在植物體內(nèi)相關(guān)的代謝途徑與嫁接提高番茄抗青枯病的機理仍有待進(jìn)一步研究。由于采用單一溶劑萃取會導(dǎo)致植物根系分泌物中的某些活性成分漏篩，可進(jìn)一步選用不同極性的有機溶劑來進(jìn)行提取和分析（祁之秋 等，2018）。對根系分泌物中的活性物質(zhì)進(jìn)行分離和分子結(jié)構(gòu)分析，合成具有殺菌活性的新型植物源制劑，將有助于田間番茄青枯病的防控。