桂超，鄧萬(wàn)凱，劉細(xì)國(guó)

0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）起源于鼻咽部黏膜上皮組織和腺體，多為低分化鱗狀細(xì)胞癌，惡性程度高且易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，是我國(guó)南方（廣東、廣西、福建、湖南和江西等）及東南亞地區(qū)較為常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。盡管目前手術(shù)聯(lián)合放化療顯著提高了鼻咽癌的治療效果，但是，中晚期鼻咽癌患者的5年生存率仍低于60%，且預(yù)后較差[2-4]。因此，深入研究鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制，尋找新的治療方法，對(duì)改善患者治療效果和預(yù)后具有重要意義。

Sestrin2是應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白Sestrins家族的重要成員，是一種進(jìn)化上高度保守的蛋白[5]。在DNA損傷、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等損傷因子的作用下，Sestrin2可通過(guò)調(diào)控腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）這兩大信號(hào)通路維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[6]。多項(xiàng)研究表明Sestrin2表達(dá)下調(diào)與多種惡性腫瘤相關(guān)，包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、骨肉瘤等[7]。然而，Sestrin2在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究首先檢測(cè)了Sestrin2在鼻咽癌患者腫瘤和癌旁組織的表達(dá)，繼而通過(guò)pcDNA3.1/Sestrin2轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-1細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)Sestrin2對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為鼻咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

收集2016年1月—2018年2月湖北省腫瘤醫(yī)院收治的46例鼻咽癌及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本。所有患者均行病理活檢，且活檢前未接受放、化療，結(jié)合臨床表現(xiàn)和鼻咽部CT檢查確診為鼻咽部鱗狀細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡<18歲或>75歲；（2）合并其他部位的原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移癌；（3）嚴(yán)重的感染性疾病及免疫功能障礙者；（4）妊娠期和哺乳期女性；（5）精神異常患者等。其中有3例因合并其他部位的原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移癌、1例因合并嚴(yán)重的感染性疾病及免疫功能障礙、1例因妊娠期排除，最終納入41例患者；所有標(biāo)本的收集均獲得患者的知情同意，并通過(guò)湖北省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑

人鼻咽癌鱗癌細(xì)胞株CNE-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，pcDNA3.1/Sestrin2質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成和鑒定。RNA提取試劑盒和CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自德國(guó)Roche公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。兔抗人Sestrin2抗體、兔抗p-AMPK抗體、兔抗人AMPK抗體、兔抗人p-mTOR抗體、兔抗人mTOR抗體和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 4%的多聚甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋后將蠟塊切成4 μm厚的組織切片。放入二甲苯后酒精梯度脫蠟，再放入微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。3%小牛血清封閉后加入Sestrin2抗體和二抗，待切片顯色后蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核，脫水封片后顯微鏡下觀察并采集圖片。Sestrin2陽(yáng)性表達(dá)物定位于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為（-），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%~25%為（+），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥25%~50%為（++），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥50%為（+++）。將（-）歸為陰性表達(dá)，（+）~（+++）歸為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染CNE-1細(xì)胞。將細(xì)胞分為三組：未處理組（正常CNE-1細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1）和轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Sestrin2）。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)Sestrin2 mRNA水平 轉(zhuǎn)染后的CNE-1細(xì)胞培養(yǎng)48h后利用TRIzol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用羅氏Lightcycler480 RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。以GAPDH作為內(nèi)參，對(duì)RT-PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析。利用Primer-BLAST在線設(shè)計(jì)引物，特異性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。GAPDH上游引物序列為5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，下游引物序列為5'-AGCCTTCTCCATGGTGGT GAAGAC-3'。Sestrin2上游引物：5'-TCTTACCTG GTAGGCTCCCAC-3'，下游引物：5'-AGCAACTT GTTGATCTCGCTG-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)Sestrin2蛋白水平 細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取總蛋白，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid, BCA）法進(jìn)行總蛋白濃度和定量檢測(cè)。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入50 μg的蛋白樣品，75 V恒壓電泳30 min后，100 V恒壓電泳2 h。待電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉60 min后，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜。隨后二抗室溫孵育1 h，利用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)每孔。每孔中加入10 μl的CCK-8溶液后37℃孵育4 h，移除上清液，加入150 μl的二甲基亞砜溶液，37℃孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度值（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后棄上清液。200 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）和5 μl碘化丙啶（PI）染色液，37℃避光孵育15 min后，加入150μl的緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非參數(shù)檢驗(yàn)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sestrin2在鼻咽癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示鼻咽癌及癌旁正常組織均有Sestrin2的表達(dá)，且腫瘤組織Sestrin2的表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00241），見(jiàn)圖1。

2.2 Sestrin2的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系

Sestrin2的低表達(dá)與TNM分期（P=0.036）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.018）相關(guān)，而與性別（P=0.781）和年齡（P=0.865）無(wú)關(guān)，見(jiàn)表1。

2.3 CNE-1細(xì)胞Sestrin2過(guò)表達(dá)的鑒定

RT-PCR和Western blot法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組CNE-1細(xì)胞中Sestrin2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于未處理組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），而未處理組和陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2、表2。

表1 Sestrin2的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系Table1 Correlation of Sestrin2 expression with clinicopathological parameters of nasopharyngeal carcinoma patients

表2 轉(zhuǎn)染后CNE-1細(xì)胞中的Sestrin2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量 (n=6)Table2 Relative expression of Sestrin2 mRNA and protein in transfected CNE-1 cells (n=6)

圖2 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Sestrin2蛋白水平Figure2 Sestrin2 protein level after transfection detected by Western blot

2.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sestrin2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于未處理組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），而未處理組和陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖 3。

*: P<0.05, compared with adjacent normal tissues

圖3 CCK-8法檢測(cè)Sestrin2過(guò)表達(dá)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure3 Effect of Sestrin2 overexpression on proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cells detected by CCK-8 assay

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示Sestrin2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率（（45.6±4.24）%）顯著高于未處理組（（11.8±1.35）%）和陰性對(duì)照組（（10.3±1.26）%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），而未處理組和陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖4。

2.6 AMPK和mTOR蛋白水平檢測(cè)

Western blot法檢測(cè)Sestrin2過(guò)表達(dá)對(duì)AMPK和mTOR通路的影響，結(jié)果顯示相較于未處理組和陰性對(duì)照組，Sestrin2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞AMPK磷酸化水平顯著升高，而mTOR磷酸化水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。而未處理組和陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3、圖5。

3 討論

鼻咽癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有明顯的種族差異和地域分布特點(diǎn)，患者病死率高且預(yù)后較差。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)方式，對(duì)改進(jìn)患者的治療方式和改善預(yù)后具有重要意義。本研究首先檢測(cè)了Sestrin2在鼻咽癌患者腫瘤和癌旁組織的表達(dá)，免疫組織化學(xué)結(jié)果提示Sestrin2在鼻咽癌組織表達(dá)降低，且Sestrin2低表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)情況密切相關(guān)，這些結(jié)果表明，Sestrin2表達(dá)下調(diào)可能與鼻咽癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。繼而我們選用經(jīng)典鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)pcDNA3.1/Sestrin2轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-1細(xì)胞，RT-PCR和Western blot結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Sestrin2的mRNA和蛋白水平顯著高于未處理組和陰性對(duì)照組，這些結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Sestrin2的鼻咽癌CNE-1細(xì)胞。

Sestrin2，又稱為低氧誘導(dǎo)基因95（Hi95），其編碼基因位于人類6號(hào)染色體的長(zhǎng)臂21位點(diǎn)。2002年，Budanov等[8]首次將Sestrin2從人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤A172細(xì)胞中克隆出來(lái)，并證實(shí)其在多種組織中表達(dá)。Sesntrin2包含2個(gè)呈對(duì)稱分布、在結(jié)構(gòu)上類似的功能域，其N末端可還原烷基過(guò)氧化物，而C末端可抑制mTOR。既往研究提示Sestrin2在多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[6]。Seo等[9]證實(shí)5-氟尿嘧啶可通過(guò)上調(diào)Sestrin2的表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。Tong等[10]的研究結(jié)果表明迷迭香酸提取物可通過(guò)上調(diào)Sestrin2的表達(dá)，抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡。本研究中，我們利用CCK-8法觀察Sestrin2過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖能力的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sestrin2過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡水平的影響。和既往研究一致，本研究結(jié)果表明Sestrin2過(guò)表達(dá)可抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的凋亡，這些結(jié)果提示Sestrin2可能是干預(yù)和治療鼻咽癌的重要靶點(diǎn)。

表3 三組細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)量 (n=6)Table3 Relative expression of proteins in nasopharyngeal carcinoma cells in three groups (n=6)

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CNE-1細(xì)胞凋亡情況Figure4 Apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells detected by flow cytometry

圖5 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后AMPK和mTOR蛋白水平Figure5 Expression levels of AMPK and mTOR proteins after transfection detected by Western blot

我們進(jìn)一步研究了Sestrin2過(guò)表達(dá)調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡的下游信號(hào)分子。AMPK是一種由異源三聚體構(gòu)成的蛋白復(fù)合物，包括α催化亞基、β和γ調(diào)節(jié)亞基。當(dāng)AMP/ATP升高時(shí)，AMP與γ調(diào)節(jié)亞基結(jié)合引起構(gòu)象改變，從而誘導(dǎo)AMPK磷酸化，調(diào)控能量物質(zhì)代謝[11]。Wei等[12]研究表明，Sestrin2過(guò)表達(dá)可通過(guò)激活A(yù)MPK通路，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。mTOR是一種相對(duì)分子質(zhì)量為289 kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其編碼蛋白由2 549個(gè)氨基酸組成。mTOR可通過(guò)整合多種細(xì)胞外信號(hào)，包括生長(zhǎng)因子、能量、營(yíng)養(yǎng)等，參與核糖體轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯和細(xì)胞凋亡等多種病理生理過(guò)程[13]。Wang等[14]表明，Sestrin2過(guò)表達(dá)可通過(guò)激活A(yù)MPK，抑制mTOR的活性，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Sestrin2過(guò)表達(dá)后的鼻咽癌中AMPK磷酸化水平升高，而mTOR磷酸化水平降低，提示過(guò)表達(dá)Sestrin2可通過(guò)激活A(yù)MPK通路，抑制mTOR通路，從而誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Sestrin2在鼻咽癌組織表達(dá)下調(diào)，且Sestrin2低表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)情況密切相關(guān)。上調(diào)Sestrin2的表達(dá)通過(guò)激活A(yù)MPK磷酸化，抑制mTOR磷酸化，抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡。本研究為防治鼻咽癌提供了新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，Sestrin2調(diào)控AMPK和mTOR信號(hào)通路的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究沒(méi)有在多種鼻咽癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，也沒(méi)有進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，下一步我們將就此繼續(xù)探討。