熊智慧 王欣晨 官海漣 金美媛

子癇前期（PE）一直是臨床研究的熱點(diǎn)，是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的主要疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有大量的證據(jù)顯示胎盤(pán)血管形成異常是子癇前期發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)中心環(huán)節(jié)，血管生成是血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)降解共同參與過(guò)程，受血管生成因子和抗血管生成因子的調(diào)節(jié)［1］。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體（hucMSCs-Exo）是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hucMSCs）通過(guò)旁分泌方式產(chǎn)生的一種直徑約30～100nm的膜性小囊泡，hucMSCs-Exo中含有多種蛋白質(zhì)，在生物活動(dòng)中起重要的調(diào)控作用，包括血管生成、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等［2-3］。已有研究報(bào)道外泌體可以促進(jìn)人臍靜脈血管及腦血管的新生［4-5］，并發(fā)現(xiàn)hucMSCs培養(yǎng)液能有效刺激胎盤(pán)血管再生［6］，而hucMSC產(chǎn)生的外泌體能否刺激胎盤(pán)血管再生尚不清楚。本研究將hucMSCs-Exo用于子癇前期胎盤(pán)血管形成異常的孕鼠模型干預(yù)治療，從胎盤(pán)血管內(nèi)皮功能修復(fù)、胎盤(pán)微血管密度來(lái)評(píng)價(jià)hucMSCs-Exo的生物學(xué)效應(yīng)，為子癇前期的治療探索一種具有廣泛應(yīng)用前景的生物制劑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司；10周齡健康SD雌性大鼠（200～250 g）購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（滬）-2013-0016］；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；FEI Tecnai 12 型透射電子顯微鏡（Philips 公司）；Biorad Gel Dol EZ 成像儀（GEL DOC EZ IMAGER，Biorad，California，USA）。

1.2 hucMSCs及hucMSCs-exo的分離提取及鑒定 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，獲取P3代細(xì)胞分別從形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀(guān)察，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志CD45、CD29、CD90、CD34、CD105鑒定、成骨成脂試驗(yàn)進(jìn)行分化能力的鑒定。超速離心取出FBS中的外泌體待用。P3代hucMSCs融合至90%左右時(shí)將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，充分收集上清液。利用超速離心方法從hucMSCs培養(yǎng)上清液中獲取hucMSCs-exo，分別進(jìn)行電鏡及蛋白CD63和CD81的鑒定。采用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 取50只受孕成功的SD大鼠連續(xù)腹腔注射L-NAME，建立子癇前期模型大鼠［7］，將模型大鼠分為5組，分別為PE組（n=10，不做任何處理）、PE+NC組［n=10、孕14d腹腔注射無(wú)菌生理鹽水，0.5ml/（只·d），共6d］；L-Exo組［n=10，孕14d腹腔注射濃度為120μg/ml的外泌體，0.5ml/（只·d），共6d］、M-Exo組［孕14d腹腔注射濃度為140μg/ml的外泌體，0.5ml/（只·d），共6d］、H-Exo組［孕14d腹腔注射濃度為160μg/ml的外泌體，0.5ml/（只·d），共6d］。

1.4 標(biāo)本收集及檢測(cè) （1）實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，麻醉大鼠后，開(kāi)腹取腹主動(dòng)脈血。ELISA檢測(cè)血清血管生成因子（VEGF）和抗血管生成因子可溶性fms-樣酪氨酸激酶受體-1（sFlt1）的水平；（2）剖宮取出胎盤(pán)組織，剪取合適大小胎盤(pán)組織于多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，兩兩比較采用最小顯著差法（LSD法），多組之間的比較采用One-Way ANOVA 單因素方差分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hucMSCs-Ex的提取和鑒定 透射電鏡下觀(guān)察到一組直徑為30～100 nm、大小不等的圓形或橢圓形膜囊泡。膜結(jié)構(gòu)在囊泡周?chē)鷧^(qū)域明顯，胞內(nèi)的電子密度較低，見(jiàn)圖1A。Western blot結(jié)果顯示hucMSCs-exo有高表達(dá)CD63和CD81，見(jiàn)圖1B-C。以上結(jié)果表明，hucMSCs-exo被成功分離。

圖1 A hucMSCs-Ex在透射電鏡下的形態(tài)學(xué)（×100000）；B hucMSCs-Ex的Western blot鑒定；C hucMSCs-Ex細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD63和CD81

2.2 hucMSCs-exo對(duì)孕鼠胎盤(pán)微血管密度（MVD）的影響 采用免疫組化法檢測(cè)胎盤(pán)組織中MVD，顯微鏡下觀(guān)察胎盤(pán)組織CD31 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況，見(jiàn)圖2A-B，400倍視野下計(jì)算單位面積內(nèi)CD31 陽(yáng)性微血管數(shù)目，隨機(jī)選取5個(gè)視野，取平均值。結(jié)果顯示PE組和PE+NC組比較，MVD在L-Exo組，M-Exo組和H-Exo組明顯升高，H-Exo高于L-Exo組和M-Exo組（P均＜0.05）。MVD在M-Exo組明顯高于L-Exo組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖2 A：免疫組化法檢測(cè)各組大鼠胎盤(pán)CD31的陽(yáng)性表達(dá)；B：各組大鼠的MVD；C：各組大鼠血清中VEGF的表達(dá)；D：各組大鼠血清中sFLT1的表達(dá)

表1 hucMSCs-exo對(duì)大鼠胎盤(pán)微血管密度的影響（x±s）

2.3 hucMSCs-exo對(duì)孕鼠血清sFlt-1及VEGF的影響 ELISA進(jìn)行VEGF和sFlt-1表達(dá)的確定，見(jiàn)圖2C-D，結(jié)果：PE組與PE+NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，VEGF的表達(dá)在L-Exo組、M-Exo組和H-Exo組明顯高于PE組和PE+NC組，而sFlt1的表達(dá)在PE組和PE+NC組則明顯下降，并且H-Exo組與PE組和PE+NC組相比有顯著差異，見(jiàn)表2-3。結(jié)果表明hucMSCs-exo通過(guò)抑制sFlt-1和促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生來(lái)促使血管內(nèi)皮修復(fù)，從而增加胎盤(pán)微血管密度，達(dá)到改善子癇前期大鼠胎盤(pán)的形態(tài)。

表2 hucMSC-exo對(duì)大鼠血清sFlt-1表達(dá)水平的影響（x±s）

表3 hucMSCs-exo對(duì)大鼠血清VEGF表達(dá)水平的影響（x±s）

3 討論

子癇前期是妊娠期常見(jiàn)的并發(fā)癥，每年有50000～100000孕產(chǎn)婦死于子癇前期，是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一［8］。子癇前期可影響機(jī)體各器官系統(tǒng)功能，在臨床上是醫(yī)源性早產(chǎn)最常見(jiàn)的原因，可導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限、胎盤(pán)早剝以及圍生兒死亡。

子癇前期一直被臨床所關(guān)注，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的探索研究，總結(jié)出多種治療子癇前期的方法，包括血管生成因子、血管舒張藥物、抗炎藥物及減少氧化應(yīng)激的藥物的應(yīng)用等［9］，但目前尚處于基礎(chǔ)研究階段，因此尋找能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮功能恢復(fù)，胎盤(pán)血管生成的治療方案尤為關(guān)鍵。近年間質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在一些領(lǐng)域已取得一定的成就，如細(xì)胞替代治療、器官移植及再生醫(yī)學(xué)［10］，但MSCs對(duì)人體也存在一定的負(fù)面作用，在免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)中的不可控性，潛在的致瘤性，異常堆積等［11］，因此，MSCs在疾病的治療中受到了限制。而外泌體作為機(jī)體細(xì)胞分泌的活性囊泡，所表現(xiàn)出來(lái)的治療優(yōu)勢(shì)被越來(lái)越多的學(xué)者所認(rèn)識(shí)。外泌體性能相對(duì)穩(wěn)定，不存在異倍體性的風(fēng)險(xiǎn)，免疫排斥機(jī)會(huì)小，并且具有母體細(xì)胞相似的生物學(xué)作用［12］，MSCs-Exo在某些疾病如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病及女性生殖系統(tǒng)疾病等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已表現(xiàn)出良好的治療策略。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子癇前期大鼠可出現(xiàn)胎盤(pán)血管不同程度的異常，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，治療組經(jīng)過(guò)1個(gè)療程的外泌體治療后，胎盤(pán)的MVD顯著升高（P＜0.05），并且通過(guò)大鼠血清中sFlt-1、VEGF的蛋白量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)1個(gè)療程的外泌體治療后，治療組的VEGF的蛋白表達(dá)量較對(duì)照組有不同程度的升高趨勢(shì)（P＜0.05），而sFlt-1蛋白則有不同程度的下降趨勢(shì)（P＜0.05）。上述研究結(jié)果提示hucMSCs-exo可在一定程度上恢復(fù)VEGF分泌的能力，促進(jìn)血管內(nèi)皮功能的恢復(fù)。其作用機(jī)制可能是hucMSCs-exo作為一種炎癥調(diào)控因子參與免疫調(diào)節(jié)，上調(diào)VEGF同時(shí)下降sFlt-1的表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和微環(huán)境調(diào)控的方式，繼而達(dá)到恢復(fù)血管內(nèi)皮的功能。由此可見(jiàn)，一定濃度的hucMSCs-exo對(duì)SD大鼠血管內(nèi)皮功能有一定的修復(fù)作用，能夠恢復(fù)胎盤(pán)血管生成能力。根據(jù)上述研究結(jié)果，可以推測(cè)hucMSCs-exo的胎盤(pán)移植，有望成為臨床防治子癇前期的新方式，然而其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究，今后可以對(duì)hucMSCs-exo所攜帶的蛋白質(zhì)及核酸分子進(jìn)行分析，找出其有效成分及發(fā)揮重要作用的細(xì)胞信號(hào)通路，或者通過(guò)人工生物合成其有效成分，更直接的促進(jìn)血管內(nèi)皮功能的恢復(fù)及胎盤(pán)血管的生成，對(duì)臨床治療子癇前期具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，hucMSCsexo可有效改善血管內(nèi)皮功能，這種作用可通過(guò)調(diào)整sFLt-1與VEGF來(lái)發(fā)揮作用，hucMSCs-exo可以成為臨床防治子癇前期的新方法，但仍需要更加深入的研究來(lái)驗(yàn)證。