陳瑋 郝建 蔡秋萍 錢(qián)鈞 吳海燕 侯曉麗

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive PulmonaryDisease，COPD）由環(huán)境中明顯的暴露因子所引起氣道和/或肺泡異常所致肺泡功能單位的結(jié)構(gòu)破壞［1］，其作為一種可預(yù)防可治療的臨床常見(jiàn)疾病之一，以氣流受限為特征。在COPD的發(fā)生發(fā)展中，呼吸道持續(xù)存在的慢性炎癥，與其心肺運(yùn)動(dòng)功能的減退有密切聯(lián)系［2］，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫學(xué)機(jī)制同樣發(fā)揮著重要的作用［3］。CD4+T細(xì)胞在不同的細(xì)胞微環(huán)境中，可以分化為T(mén)reg和Th17細(xì)胞亞群，Th17可通過(guò)分泌IL-6、IL-7、IL-17、IL-21、IL-22等炎性細(xì)胞因子來(lái)募集巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，促使炎性因子的釋放并加劇炎癥反應(yīng)［4-6］。Treg細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子對(duì)疾病的炎癥反應(yīng)起到抑制的作用［7-8］，減輕自身的免疫應(yīng)答和降低氧化反應(yīng)所致的損傷。本課題希望通過(guò)研究Treg細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子IL-17和TGF-β與心肺功能和肺功能之間的相關(guān)性來(lái)探討慢性炎癥對(duì)COPD患者臨床癥狀及運(yùn)動(dòng)耐量降低的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取在2016年1月至2017年12月期間中國(guó)人民解放軍杭州128醫(yī)院COPD穩(wěn)定期患者30例設(shè)為觀察組，體檢中心健康人員30例設(shè)為正常組。兩組性別、年齡、體重、身高差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2016年COPD診斷和分組標(biāo)準(zhǔn)；（2）病情嚴(yán)重程度：選取中重度的COPD緩解期患者且不伴有肺動(dòng)脈高壓；（3）曾使用有創(chuàng)或無(wú)創(chuàng)機(jī)械通氣治療；（4）無(wú)嚴(yán)重心、肝、腎及其他影響鍛煉的局部或全身性疾病；（5）排除急性發(fā)作者；本項(xiàng)目必須經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)取得患者及其家屬的知情同意，并簽署同意書(shū)。

表1 兩組一般臨床資料比較（x±s）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定 （1）流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定：研究對(duì)象分別通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定血清中的Treg亞群細(xì)胞比例，研究方法和測(cè)定過(guò)程如下。①準(zhǔn)備細(xì)胞：分別抽取患者空腹?fàn)顟B(tài)下的肘靜脈血6ml，均分3ml分別置于已備制的200μl抗凝血（肝素）的2只試管內(nèi)，然后，加入2ml 1X Lysing solution（10X加水稀釋?zhuān)┢颇?0min后，作離心處理，以200r/min離心5min，隨后加入2ml staining buffer（PBS-BSA）重懸細(xì)胞固定5min，以相同轉(zhuǎn)速再次離心5min，吸取上清液，加入150μl staining buffer重懸細(xì)胞備用。②表面抗體染色：取100μl細(xì)胞懸液，加入相應(yīng)的表面抗體染色，保存于4℃保存箱中30min，結(jié)束后加入2ml staining bufler后以200 r/min離心5min。③固定及胞內(nèi)染色：在備用細(xì)胞懸液管中，加入1ml 1X Fix/Perm buffer，4℃放置50min，加入1ml 1X Perm/wash bufler，350r/min，4℃離心5min，再次加入2ml 1X Perm/wash bufler，重懸細(xì)胞，350r/min，4℃離心5min，每管加入100μl 1X Perm/wash bufler重懸細(xì)胞，加入FOXP3和IL17A胞內(nèi)，混勻細(xì)胞，之后加入2ml IX Perm/wash bufler，350r/min，4℃離心5min，棄上清液，重復(fù)操作，加入350μl staining buffer重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)，以上操作實(shí)驗(yàn)均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)臨床基礎(chǔ)研究所流式細(xì)胞室內(nèi)完成。（2）細(xì)胞因子測(cè)定：研究對(duì)象使用ELISA方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況，具體實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定如下。抽取患者肘靜脈血中的上清液200μl至離心管中。在20℃下，以200r/min速度離心4min。隨后通過(guò)ELISA法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)血清中的細(xì)胞因子的濃度，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于浙江中醫(yī)藥大學(xué)臨床基礎(chǔ)研究所。上述測(cè)量指標(biāo)主要試劑及儀器：流式細(xì)胞檢測(cè)過(guò)程中所使用的試劑購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；Human IL-17 ELISA KIT、Human TGF-β ELISA KIT等購(gòu)自杭州達(dá)真生物技術(shù)有限公司；Bio-Tek ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，DGG-9240A型電熱恒溫箱，微量移液器（京君龍實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)centrifuge 5804R（Univer，德國(guó)）；4℃保存箱（Panasonic，日本）。（3）肺功能指標(biāo)：凡入選對(duì)象均采用肺功能儀（CHEST AC-8800，日本）監(jiān)測(cè)正常組及觀察組用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV1/FVC）等指標(biāo)，以上指標(biāo)的測(cè)量在杭州128醫(yī)院心肺康復(fù)科實(shí)驗(yàn)室完成。（4）心肺功能運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)（CPET）指標(biāo)：采用心肺運(yùn)動(dòng)儀（Cosmed 2900型，意大利）監(jiān)測(cè)正常組及觀察組峰值公斤攝氧量（Peak VO2/kg）、峰值功率（Peak Power）、CO2排出量（Peak VCO2）等指標(biāo)。運(yùn)動(dòng)方式：為踩功率車(chē)；運(yùn)動(dòng)內(nèi)容：開(kāi)始時(shí)，在10W功率的情況下運(yùn)動(dòng)10min，再通過(guò)取無(wú)氧閾時(shí)功率的70%，作為運(yùn)動(dòng)負(fù)荷完成運(yùn)動(dòng)，以上指標(biāo)的測(cè)量在杭州128醫(yī)院心肺康復(fù)科實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)比較各組間的均數(shù)差異，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，各組間數(shù)據(jù)的相關(guān)關(guān)系使用pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Treg亞群細(xì)胞比例及外周血中細(xì)胞因子的變化情況 觀察組患者外周血中的Treg亞群細(xì)胞比例較正常組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組患者外周血中的細(xì)胞因子IL-17及TGFβ表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 兩組外周血Treg亞群細(xì)胞比例、細(xì)胞因子變化情況（x±s）

2.2 心肺運(yùn)動(dòng)功能及肺功能變化情況 觀察組患者的Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2較正常組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組患者的FVC和FEV1/FVC較正常組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 兩組心肺運(yùn)動(dòng)功能及肺功能變化情況比較（x±s）

2.3 Treg亞群細(xì)胞及血中細(xì)胞因子與心肺運(yùn)動(dòng)功能的相關(guān)性 觀察組患者Peak VO2/kg、Peak Power、Peak VCO2與Treg細(xì)胞亞群比例呈正相關(guān)（P＜0.05），上述指標(biāo)與IL-17及TGF-β表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（見(jiàn)表4）。

表4 觀察組外周血炎性因子水平與心肺運(yùn)動(dòng)功能的相關(guān)性（x±s）

3 討論

在多種疾病的發(fā)展過(guò)程中，Th17和Treg細(xì)胞亞群比例失調(diào)起到重要的作用，例如急性冠脈綜合征（ACS）［9］、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）［10］和銀屑?。?1］等。在特定的微環(huán)境中，受不同受體特異性調(diào)控，在IL-6、TGF-β的誘導(dǎo)下CD4+細(xì)胞趨向分化為T(mén)h17細(xì)胞亞群；而在TGF-β的刺激下，趨向分化為T(mén)reg細(xì)胞亞群。Pack等［12］新發(fā)現(xiàn)，Th17作為T(mén)h細(xì)胞亞群的一種，其介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答與Treg亞群所具有的免疫抑制作用，在功能上相互拮抗，在正常機(jī)體內(nèi)維持動(dòng)態(tài)平衡，并對(duì)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和維持免疫耐受起到重要的作用。許多研究表明，Th17/Treg的失衡在免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用。

研究已表明，慢性炎癥反應(yīng)是COPD不斷進(jìn)展的重要原因［13］，巨噬細(xì)胞在其外周的氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺部血管中增加，同時(shí)活化后的中性粒細(xì)胞和相關(guān)淋巴細(xì)胞可以增加炎癥因子的釋放，增加氣道的高反應(yīng)性，使得氣道重塑，導(dǎo)致肺功能的進(jìn)一步損傷［14］。

多項(xiàng)研究表明，COPD穩(wěn)定期患者外周血中的Treg細(xì)胞亞群比例明顯降低，而細(xì)胞因子IL-17及TGF-β表達(dá)水平升高［15］，提示穩(wěn)定期的COPD患者，其免疫平衡狀態(tài)受到破壞，介導(dǎo)炎癥作用的細(xì)胞因子表達(dá)加強(qiáng)，而抗炎作用減弱。本實(shí)驗(yàn)中，觀察組Treg細(xì)胞亞群比例較正常組明顯降低，IL-17及TGF-β表達(dá)水平較正常組升高，此況與文獻(xiàn)報(bào)道情況相似，提示COPD患者炎性細(xì)胞因子顯著上升，抑制性炎癥因子下降，機(jī)體的免疫平衡遭到破壞，機(jī)體對(duì)抗炎性物質(zhì)的能力下降。雖然由Treg細(xì)胞亞群分泌的TGF-β作為一種抑制性炎癥因子，調(diào)控抑制淋巴細(xì)胞增殖，但其同樣也可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞趨化，成為炎癥反應(yīng)發(fā)生的媒介，在COPD患者中出現(xiàn)升高的趨勢(shì)。本組實(shí)驗(yàn)研究提示，通過(guò)CPET所測(cè)得的Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2，均顯著性低于正常組；同時(shí)肺功能所測(cè)得的FVC和FEV1/FVC也顯著性低于正常組，提示隨著患者免疫平衡破壞，機(jī)體持續(xù)維持應(yīng)激狀態(tài)，致肺功能的損害進(jìn)一步的發(fā)生，使其心肺功能儲(chǔ)備及運(yùn)動(dòng)耐量下降，生活質(zhì)量逐步下降。CPET指標(biāo)Peak VO2/kg、Peak Power和Peak VCO2與Treg細(xì)胞亞群水平呈正相關(guān)，而與血清IL-17、TGF-β成負(fù)相關(guān)，提示COPD患者的心肺功能降低程度與機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)，隨著慢性炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，其心肺功能逐漸降低，使得COPD患者氣流受限加重，呼吸道癥狀反復(fù)發(fā)作。

綜上所述，在COPD患者氣道慢性炎癥的發(fā)展過(guò)程中，Treg細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子比例的失調(diào)起到重要的作用，可以發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞亞群比例及其細(xì)胞因子對(duì)COPD穩(wěn)定期患者臨床癥狀、健康狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)耐量均有顯著的相關(guān)性。在今后的研究中，注重觀察對(duì)Th17/Treg細(xì)胞亞群比值與CPET對(duì)其他呼吸系統(tǒng)疾病的影響，進(jìn)一步探討慢性炎癥反應(yīng)對(duì)呼吸系統(tǒng)氣道高反應(yīng)性的作用機(jī)制。