張 玲， 蘆顏美， 周賢惠， 李耀東， 邢 強， 張疆華， 湯寶鵬

(新疆醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)研究院科研基地科， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院心臟起搏電生理科， 烏魯木齊 830054)

心房顫動(簡稱房顫)是臨床最常見的持續(xù)性心律失常之一，發(fā)病率隨著年齡增加而增加，給人民生活質(zhì)量和經(jīng)濟帶來巨大負擔(dān)[1-3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)起源于左房的房顫較右房的更多[4-5]，Embi等[6]研究結(jié)果顯示羊心右心耳和左心耳糖原的密度和分布不同，左耳較右耳有更多的糖原分布。以上研究為左房較右房更容易發(fā)生房顫提供了組織學(xué)基礎(chǔ)。

房顫時發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)的表現(xiàn)為細胞間質(zhì)纖維化，致心肌收縮性減弱并心臟體積增大[7]。但在房顫從急性至慢性進展過程中的膠原纖維及糖原沉積變化尚不清楚。本課題組之前的研究報道了48 h及8周左心耳起搏慢性房顫模型左右心耳在48 h及8 周房顫的膠原纖維及糖原的變化情況[8]，但未有HE染色、左、右心房及超微結(jié)構(gòu)變化的報道。本研究通過右心房快速起搏48 h及8 周建立犬房顫模型，通過HE染色、糖原染色及馬松(Masson)染色觀察犬在房顫進展過程中大體結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的變化及糖原和膠原纖維的變化，為房顫的結(jié)構(gòu)重構(gòu)的機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取成年比格犬18只，雌雄不限，體質(zhì)量 (12±2.23) kg，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。通過Lead 7000電生理儀持續(xù)監(jiān)測和記錄。實驗設(shè)計和實施均通過了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 實驗動物分組及房顫模型的制作實驗動物用隨機數(shù)字表法被隨機分為3組：對照組(control組)，6只，犬植入起搏器不起搏；起搏48 h組(48 h AF 組)，6只，犬經(jīng)頸靜脈穿刺，通過7 F鞘管送入10極電極至高位右心房，以600次/min起搏，2倍的閾值電壓刺激高右房，待心電監(jiān)測出現(xiàn)房顫心電圖后開始持續(xù)起搏48 h。起搏8 周組(8 w AF 組)，6只，犬右側(cè)開胸，暴露心臟并心包吊籃，雙極電極縫于右心耳，縫合關(guān)閉心包。電極連于起搏器電極發(fā)生器。起搏器縫于右側(cè)胸肌囊袋內(nèi)。1周恢復(fù)后，起搏器打開并發(fā)放刺激，頻率為600 次/min。心電圖記錄出現(xiàn)房顫圖像后，持續(xù)起搏8周[9-10]。

1.3 組織學(xué)收集和處理造模結(jié)束后給予高劑量的戊巴比妥納實行安樂死，取出心臟。將左、右心房組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋。組織均根據(jù)染色的標(biāo)準(zhǔn)過程進行HE染色，糖原和Masson染色。電鏡標(biāo)本的留取，安樂死后即刻取左右心房組織切成1 mm3大小，4%戊二醛固定2 h，1/15 moL磷酸鹽緩沖液漂洗，1%四氧化餓固定，丙酮脫水。丙酮浸透1 h后包埋并超薄切片，醋酸鈾染色15～30 min，后透射電鏡觀察和采圖[8-9,11]。

1.4 組織影像的形態(tài)學(xué)分析染色的切片通過連接于倒置顯微鏡(Carl Zeiss，German)上的CCD攝像機捕捉，并用Axio Vision software(Axio Vision 4.1 Zeiss. German)軟件進行分析。所有切片采樣均在同樣的采樣下進行。糖原染色陽性細胞的測定和膠原陽性纖維的測定分別采取20×倍和 40×倍放大。糖原染色陽性區(qū)域和膠原纖維的量化測量采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics，Inc.)。糖原和纖維的測量采用染色區(qū)域/ 圖形的總面積[8-9,11]。

2 結(jié)果

2.1 模型制作完成情況急性及慢性房顫模型的制作方法均參照文獻[9-10]進行模型制作方法。18只犬均順利完成整個實驗過程。實驗過程中，血壓心率平穩(wěn)，無心衰現(xiàn)象發(fā)生。所有模型房顫成功率100%。

2.2 房顫模型心電圖檢測所有實驗犬基礎(chǔ)狀態(tài)體表心電圖均呈竇性心律，control 組于8周內(nèi)每周行心電圖觀察均為竇性心律，48 h AF組起搏后即刻便為房顫心律，持續(xù)心電監(jiān)測均為房顫心律。8 w AF組起搏器開啟后數(shù)小時變?yōu)榉款澬穆桑?周內(nèi)每周行心電圖觀察起搏器工作狀態(tài)下均為房顫心律。

2.3 組織學(xué)研究

2.3.1 HE染色的比較 control組犬左心房組織切片HE染色可見心房肌細胞排列整齊，核清晰，周圍僅有少量間質(zhì)。48 h AF組HE染色較control組無明顯變化。8 w AF組犬左心房組織切片上HE染色可見心房肌細胞核大小不規(guī)則清晰度明顯降低，心肌纖維排列明顯紊亂，核異型明顯，細胞內(nèi)可見肌纖維斷裂；結(jié)締組織增生，心肌細胞間隔明顯增寬，見圖1。

control 組 48 h AF 組 8 w AF 組

圖1 3組左心房HE染色(×100)

2.3.2 糖原染色的比較 圖2顯示了control組、48 h AF組、8 w AF 組左心房(LA) 和右心房(RA)糖原分布的比較。糖原染色結(jié)果顯示，control組LA和RA心肌細胞僅有少量糖原聚集，48 h AF組心肌細胞糖原染色陽性物質(zhì)較control組增多,LA多于RA，8 w AF 組胞漿內(nèi)糖原顆粒明顯增多形成糖原湖，LA較RA更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.3 馬松染色 膠原纖維的分布通過馬松染色來判斷。圖3顯示了control 組、48 h AF組、8 w AF 組 LA和RA膠原沉積的比較。Masson染色結(jié)果顯示，心肌纖維為紅色，膠原纖維為藍綠色，control 組犬心肌有少量膠原均勻分布于肌纖維之間。48 h AF組膠原纖維輕度增多,8 w AF組心肌細胞排列紊亂，膠原纖維大量分布于肌纖維之間且相互連接成網(wǎng)狀，排列紊亂，分布不均勻，LA較RA更明顯，8 w AF 組纖維化程度較48 h AF組更重。

2.4 電鏡結(jié)果的分析control 組肌原纖維細胞排列整齊緊密，心肌細胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)線粒體大小均一分布，膜完整，脊清楚，閏盤結(jié)構(gòu)完整，胞漿豐富，見圖4a。48 h AF 組心肌細胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，肌纖維間質(zhì)增寬，間質(zhì)部線粒體聚集，見圖4b。8 w AF 組線粒體腫脹變長，體積增大，基質(zhì)變淡。肌原纖維排列紊亂，肌節(jié)長短不一；糖原聚集，峭異形明顯，心肌閏盤不連續(xù)，扭曲，見圖4c、4d。

a: control組肌原纖維細胞排列整齊緊密，心肌細胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)線粒體大小均一分布，膜完整，脊清楚，閏盤結(jié)構(gòu)完整，胞漿豐富。 b: 48 h AF 組心肌細胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，肌纖維間質(zhì)增寬，間質(zhì)部線粒體聚集。

c: 8 w AF組心肌細胞間線粒體變長，增多線粒體腫脹，體積增大，基質(zhì)變淡。

d: 8 w AF組肌原纖維排列紊亂，肌節(jié)長短不一；糖原聚集，細胞器數(shù)量增多，峭異形明顯，心肌閏盤不連續(xù)，扭曲。

圖4 control組、48 h AF組、8 w AF組心肌細胞馬松染色電鏡觀察

3 討論

通過持續(xù)快速心房起搏構(gòu)建房顫模型是目前最常用的建立房顫模型的方法[10-11]。人和動物研究均發(fā)現(xiàn)，LA起源的房顫更常見，左、右心房的結(jié)構(gòu)特征、蛋白表達均有不同。由于左、右心房的解剖等特性，使LA更易發(fā)生房顫[12-13]。先前的研究也發(fā)現(xiàn)，在基線狀態(tài)左心耳較右心耳有更多的糖原聚集，通過左心耳起搏建立AF模型后48 h及8 周均出現(xiàn)了LA的糖原聚集比RA更明顯的現(xiàn)象，且8 周糖原聚集程度較48 h更重，LA的糖原分布可從閏盤延伸到心肌細胞[9]，這些發(fā)現(xiàn)表明這些部位的糖原聚集可能在橫向和縱向方向阻礙了心肌細胞間的電傳導(dǎo)，這些異質(zhì)性分布的阻礙傳導(dǎo)的糖原島使得非單一激動波陣形成緩慢的傳導(dǎo)異向性，而由于左側(cè)糖原分布更多使得LA來源的房顫較RA更容易發(fā)生。在本研究中，在基線狀態(tài)，即使使用右心房起搏，LA的糖原累積仍較RA明顯。提示無論LA起源或RA起源的房顫，均可造成LA的糖原累積程度較右側(cè)重。無論在基線還是AF的進展階段，LA及RA的糖原濃度和分布的不同可能促進了房顫發(fā)生。

房顫及其伴隨的心血管疾病常?？赡苷T發(fā)心房肌在組織學(xué)水平及超微結(jié)構(gòu)不同程度的變化。房顫的病史越長，結(jié)構(gòu)重構(gòu)的程度越重。房顫是一種伴隨著心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)的心律失常，房顫既是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的結(jié)果，隨著房顫的發(fā)展也可促進心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的進展。因此一旦發(fā)生了結(jié)構(gòu)重構(gòu)，即使恢復(fù)為竇性心律，也僅有非常少的結(jié)構(gòu)重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)。而心肌細胞之間的膠原沉積是房顫啟動的重要因素，也是房顫導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的最主要的變化。纖維化是房顫的重要基質(zhì)及電生理傳導(dǎo)阻滯的重要原因，表現(xiàn)為橫向及縱向的雙向阻滯，從而造成了分割的波陣從而促進了折返的形成[14-15]。本研究結(jié)果顯示,糖原聚集和其他因素，神經(jīng)和電生理的變化，為陣發(fā)性房顫提供了基質(zhì)的同時，起搏8周誘發(fā)的房顫膠原纖維明顯增加為AF的維持提供了基質(zhì)。已有的研究證據(jù)也顯示糖原累積和纖維化是房顫形成的長期持續(xù)性的形式[16-17]。

超微結(jié)構(gòu)方面，從透射電鏡可以看出房顫48 h后僅出現(xiàn)心肌細胞間線粒體聚集心肌能量代謝異常，8 周后可見心肌細胞肌原纖維排列紊亂，心肌閏盤不連續(xù)，肌節(jié)長短不一。線粒體變長，基質(zhì)變淡,線粒體脊變短、異形。并出現(xiàn)糖原聚集。隨著房顫從陣發(fā)性變?yōu)槌掷m(xù)性，結(jié)構(gòu)重構(gòu)使得無論經(jīng)典抗心律失常藥物還是單純肺靜脈隔離的房顫治療都無效[18-19]。因此，房顫的治療中至關(guān)重要的是在房顫發(fā)生的早期預(yù)防心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)、纖維化、糖原聚集及超微結(jié)構(gòu)的改變。