張艷楠， 吉騰飛， 顧政一

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050; 3新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所， 烏魯木齊 830004)

大戟脂(Euphorbium)為大戟科(Euphorbiaceae)植物多脂大戟(EuphorbiaresiniferaBerg)的樹脂狀分泌物，主要分布于歐洲的英國、俄羅斯等國家[1]，主要含有萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類等化學(xué)成分[2-3]，具有抗腫瘤、抗菌抗炎、強(qiáng)筋健骨、散寒止痛、通利腸阻等功效 ，臨床用于濕寒性或黏液質(zhì)性疾病，如癱瘓、昏迷、抽搐、關(guān)節(jié)疼痛、腹水等疾病[4]，大戟脂為毒性藥材，臨床應(yīng)慎用[5]。本研究采用硅膠柱色譜、SephadexLH-20、ODS 柱色譜等分離方法對(duì)大戟脂進(jìn)行分離純化，利用核磁共振技術(shù)對(duì)分離純化的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Unity-Inova 400型和500型超導(dǎo)核磁共振譜儀(美國Varian公司)；Micromass Auto spec-Ultima ETOF型質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；OSB2200型薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；CH1111型冷卻水循環(huán)裝置(上海愛朗儀器有限公司)；FAI604型萬分之一天平(上海天平儀器廠)；JA5003B型千分之一天平(上海越平儀器有限公司)；Agilent HP1260型高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國)有限公司]；RpC18制備型高效液相色譜儀[賽譜銳思(北京)科技有限公司]。

1.2 試劑HSGF254硅膠(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，批號(hào)20181210)，柱層析硅膠 (青島海洋化工廠，批號(hào)20180325)，MCI-GEL小孔樹脂(瑞典Amershan Pharmacia公司，批號(hào)20170807)，Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(瑞典Amershan Pharmacia公司，批號(hào)20170820)，氘代試劑(僑儀生物科技有限公司，批號(hào)20180311)，甲醇(北京化工廠，批號(hào)20170816)，石油醚(北京化工廠，批號(hào)20170812)，乙酸乙酯(北京化工廠，批號(hào)20170812)，丙酮(北京化工廠，批號(hào)20170812)，二氯甲烷(北京化工廠，批號(hào)20170812)，乙醇(北京化工廠，批號(hào)20180310)，色譜甲醇(百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)20180412)，茴香醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20171205)，濃硫酸(北京化工廠，批號(hào)20180310)，純凈水(杭州娃哈哈公司，批號(hào)20180723)，所用試劑均為分析純。

1.3 藥材大戟脂藥材2015年8月購于新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市藥材公司，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所馬林副研究員鑒定為大戟科植物多脂大戟(EuphorbiaresiniferaBerger)的樹脂狀分泌物，標(biāo)本現(xiàn)存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所標(biāo)本室(標(biāo)本號(hào)：ID-S-2614)。

2 方法與結(jié)果

2.1 大戟脂的提取與分離方法稱取粉碎后的大戟脂(20.0 kg)，加入10倍量95%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，將提取液減壓回收溶劑得乙醇浸膏6.0 kg，混懸于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物3.5 kg，經(jīng)減壓硅膠柱4.8 kg進(jìn)行色譜分離，依次用石油醚-乙酸乙酯(1∶0～0∶1)，95%乙醇梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢查，合并相似流分，得8個(gè)流分(fr1～fr8)。fr3(725.8 g)經(jīng)MCI減壓柱進(jìn)行色譜分離，依次用60～95%乙醇，丙酮進(jìn)行洗脫得10個(gè)流分(frA～frJ)。其中frC～frD合并(226.0 g)經(jīng)硅膠減壓柱色譜分離，依次用石油醚-乙酸乙酯(1∶0～0∶1)洗脫，得12個(gè)流分(frA1～frA12)。frA1(2.6 g)經(jīng)多次硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(20∶1)和二氯甲烷(100∶1)洗脫，得到化合物1(23 mg)、2(10 mg)。frA2～frA4合并得52 g, 經(jīng)ODS反相柱色譜分離(85%～100% MeOH)得到3個(gè)組分(frAa～frAc)。最終從(frAa～frAb)中通過制備型高效液相制備(95%甲醇)純化得到化合物3(20 mg)、4(15 mg)、5(17 mg)、6(32 mg)、7(27 mg)，fr Ac中通過制備型高效液相制備(87%甲醇)純化得到化合物8(18 mg)、 9(6 mg)、10(12 mg)。TLC在紫外燈254 nm和365 nm下觀察，通過噴5%硫酸茴香醛乙醇溶液或10%硫酸-乙醇顯色劑后加熱顯色檢測(cè)。

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物1 白色固體，熔點(diǎn)mp 160～162℃，易溶于氯仿。ESI-MS m/z 431[M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz)δ:0.67(3H, s, CH3-18), 0.92(3H, d,J=6.3 Hz, CH3-21), 1.01(3H, s, CH3-18), 2.03(3H, s，OCOCH3), 3.66(3H, s, COOCH3), 4.60(1H, m, CH-3), 5.36(1H, d,J=6.3 Hz, CH-6);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 174.91(COOCH3), 170.69(OCOCH3), 139.79(C-5), 122.74(C-6), 74.11(C-3), 56.78(C-14), 55.90(C-17), 51.63(COOCH3), 50.12(C-9), 42.50(C-13), 39.83(C-12), 38.25(C-4), 37.13(C-10), 36.72(C-1), 35.51(C-20), 32.00(C-23), 31.99(C-22), 31.20(C-7), 31.16(C-8), 28.24(C-2), 27.91(C-15), 24.39(C-16), 21.59(C-OCOCH3), 21.15(C-11), 19.45(C-19), 18.45(C-21), 12.00(C-18)。與文獻(xiàn)[6]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物1為methyl (20R)-3β-acetoxychol-5-en-24-oate，見圖1。

2.2.2 化合物2 白色片狀結(jié)晶，熔點(diǎn)mp 186～187℃，易溶于氯仿。ESI-MS m/z 397[M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz)δ:0.57(3H, s, CH3-18), 0.82(3H, d,J=6.4 Hz, CH3-27), 0.85(3H, d,J=8.0 Hz, CH3-26), 0.91(3H, d,J=6.8 Hz, CH3-28), 1.02(3H, s, CH3-19), 1.03(3H, s, CH3-21), 5.20(3H, m, H-7, 22, 23);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ:212.18(C-3), 139.67(C-8), 135.72(C-22), 132.13(C-23), 117.15(C-7), 56.09(C-17), 55.16(C-14), 49.01(C-9), 44.40(C-4), 43.43(C-13), 43.02(C-5), 42.96(C-24), 40.63(C-20), 39.48(C-12), 38.93(C-1), 38.28(C-2), 34.57(C-10), 33.24(C-25), 30.21(C-6), 28.24(C-16), 23.07(C-15), 21.86(C-11), 21.27(C-21), 20.10(C-26), 19.80(C-27), 17.75(C-28), 12.61(C-19), 12.30(C-18)。與文獻(xiàn)[7]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物2為ergosta-7, 22-diene-3-one，見圖2。

2.2.3 化合物3 淡黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MS m/z 279[M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz)δ:0.96(6H, t,J=7.2 Hz, H-4′, 4″), 1.47(4H, m, H-3′, 3″), 1.72(4H, m, H-2′, 2″), 4.30(4H, t,J=6.4 Hz, H-1′, 1″), 7.53(2H, dd,J=3.2, 5.6 Hz, H-3, 4), 7.70(2H, dd,J=3.6, 6 Hz, H-2, 5);13C-NMR(CDCl3, 100 MHz) δ:167.87(C-7,8), 132.46(C-3, 4), 31.06(C-2, 5), 128.99(C-1, 6), 65.72(C-1′, 1″), 30.72(C-2′, 2″), 19.33(C-3′, 3″), 13.87(C-4′, 4″)。與文獻(xiàn)[8]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物3為鄰苯二甲酸二丁酯，見圖3。

2.2.4 化合物4 無色油狀物，易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑。ESI-MS m/z 391[M+H]+。1H-NMR(CD3COCD3, 400 MHz)δ:0.89(6H, d,J=6.8 Hz, H-b′, b″), 0.94(6H, d,J=7.6 Hz, H-6′, 6″), 1.37(16H, m, 8×CH2), 1.69(2H, m, H-2′, 2″), 4.21(4H, d,J=6.0, 4.8 Hz, H-1′, 1″), 7.66(2H, dd,J=6.0, 3.6 Hz, H-4, 5), 7.75(2H, dd,J=5.6, 3.2 Hz, H-3, 6);13C-NMR(CD3COCD3,100 MHz)δ:168.41(C=O), 133.61(C-1, 2), 132.16(C-3, 6), 129.78(C-4, 5), 68.46(C-1′, 1″), 39.82(C-2′, 2″), 31.32(C-3′, 3″), 29.85(C-4′, 4″), 24.65(C-a′, a″), 23.78(C-5′, 5″), 14.47(C-6′, 6″), 11.46(C-b′, b″)。與文獻(xiàn)[9]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物4為鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，見圖4。

2.2.5 化合物5 無色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇。ESI-MS m/z 663[M+Na]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz)δ:0.82(3H, s, CH3-19), 0.92(3H, d,J=7.2 Hz, CH3-16), 1.02(1H, m, H-11), 1.04(3H, m, CH3-20), 1.05(3H, s, CH3-18), 1.12(1H, dd,J=10.4, 9.2 Hz, H-9), 1.67(1H, d,J=14.8 Hz, H-1β), 2.06(3H, s, CH3-17), 2.49(1H, m, H-2), 2.77(1H, dd,J=15.2, 9.2 Hz, H-1α), 2.88(1H, dd,J=7.2, 4 Hz, H-13), 3.65(2H, s, CH2), 3.79(3H, s, OCH3), 4.53(1H, dd,J=10.8, 1.6 Hz, H-8), 4.82(1H, dd,J=10.8, 4 Hz, H-12), 5.15(1H, d,J=8.4 Hz, H-13), 5.40(1H, brs, CH3-7), 6.84(2H, d,J=10.8 Hz, CH2=), 7.18(2H, d,J=8.4 Hz, CH2=), 1.97(3H, s, OAc), 2.06(3H, s, OCOCH3), 2.09(3H, s, OCOCH3);13C-NMR(CDCl3, 100 MHz) δ: 207.70(C-14), 170.78(C-OAc), 170.72(OCOCH3), 170.51(OCOCH3), 170.43(C=O, C-1′), 158.87(C-14), 139.45(C-6), 130.43(C-4′, 8″), 125.95(C-3′), 117.20(C-5), 114.12(C-5′, 7′), 76.68(C-7), 77.00(C-3), 73.43(C-4), 71.56(C-8), 71.22(C-15), 70.72(C-12), 55.38(C-9′), 43.16(C-13), 40.69(C-2′), 31.57(C-1), 30.76(C-11), 29.61(C-2), 29.20(C-18), 24.74(C-9), 21.14(OCOCH3), 21.07(OCOCH3), 20.68(OCOCH3),19.38(C-10), 17.57(C-17), 17.07(C-16), 16.19(C-19), 13.52(C-20)。與文獻(xiàn)[10]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物5為ingol-7, 8, 12-triacetate3-(4-methoxyphenyl)acetate，見圖5。

2.2.6 化合物6 無色膠狀固體，易溶于甲醇。ESI-MS m/z 441[M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 0.77(3H, s, CH3-18), 0.80(3H, s, CH3-29), 0.88(3H, s, CH3-30), 0.89(3H, d,J=5.8 Hz, CH3-21), 0.95(3H, s, CH3-19), 1.00(3H, s, CH3-28), 1.75(3H, s, CH3-27), 3.23(1H, dd,J=12.0, 4.0 Hz, H-3), 6.48(1H, t,J=8.0 Hz, H-24), 9.39(1H, s, H-26);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 35.38(C-1), 28.06(C-2), 79.11(C-3), 39.08(C-4), 51.09(C-5), 19.06(C-6), 27.80(C-7), 133.60(C-8), 134.17(C-9), 37.41(C-10), 21.63(C-11), 31.19(C-12), 44.26(C-13), 50.19(C-14), 29.85(C-15), 28.28(C-16), 49.69(C-17), 15.91(C-18), 20.29(C-19), 36.04(C-20), 18.99(C-21), 34.01(C-22), 26.02(C-23), 155.64(C-24), 139.23(C-25), 195.55 (C-26), 9.36(C-27), 28.19(C-28), 15.68(C-29), 24.59(C-30)。與文獻(xiàn)[11]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物6為eupha-8, 24-diene-3-ol-26-al，見圖6。

2.2.7 化合物7 無色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)mp 165～167℃，易溶于二氯甲烷、氯仿。ESI-MS m/z 427, [M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 0.75(3H, s, CH3-30), 0.80(3H, s, CH3-18), 0.86(3H, d,J=6.0 Hz,CH3-21), 0.87(3H, s, CH3-28), 0.95(3H, s, CH3-19), 1.00(3H, s, CH3-29), 1.60(3H, s, CH3-27), 3.24(1H, dd,J=12.0, 4.8 Hz, H-3α), 5.09(1H, t,J=6.8 Hz, H-24);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 134.16(C-8), 133.69(C-9), 131.02(C-25), 125.36(C-24), 79.15(C-3), 51.10(C-5), 50.17(C-14), 49.77(C-17), 44.26(C-13), 39.09(C-10), 37.41(C-4), 36.03(C-20), 35.56(C-1), 35.40(C-2), 31.04(C-15), 29.91(C-16), 28.30(C-29), 28.20(C-12), 27.82(C-2), 25.90(C-26), 24.91(C-23), 24.62(C-28), 21.68(C-11), 20.29(C-19), 19.09(C-21), 19.07(C-6), 17.84(C-27), 15.77(C-18), 15.68(C-30)。與文獻(xiàn)[12]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物7為大戟醇(euphol)，見圖7。

2.2.8 化合物8 白色粉末，熔點(diǎn)mp 175～178℃，易溶于甲醇。ESI-MS m/z 459[M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 0.65(3H, s, CH3-18), 0.74(3H, s, CH3-28), 0.91(3H, d,J=6.4 Hz, CH3-21), 1.07(3H, s, CH3-30), 1.08(3H, s, CH3-29), 1.22(3H, s, CH3-26), 1.23(3H, s, CH3-27), 3.30(1H, d,J=9.6 Hz, H-24), 5.29(1H, d,J=6.0 Hz, H-11);13C-NMR(CDCl3, 100 MHz) δ: 217.37(C=O), 147.39(C-9), 116.44(C-11), 79.65(C-24), 74.34(C-25), 53.56(C-5), 51.01(C-17), 47.85(C-4), 47.14(C-14), 44.48(C-13), 42.03(C-8), 39.22(C-10), 37.33(C-12), 36.89(C-1), 36.20(C-20), 35.03(C-22), 34.05(C-2), 33.70(C-15), 28.76(C-16), 27.87(C-7), 27.70(C-23), 26.78(C-29), 25.72(C-26), 22.73(C-27), 22.60(C-6), 21.96(C-19), 21.87(C-30), 18.58(C-28), 18.36(C-21), 14.58(C-18)。與文獻(xiàn)[13]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物8為3-oxolanost-9(11)-ene-24S,25-diol，見圖8。

2.2.9 化合物9 白色塊狀結(jié)晶，易溶于甲醇。ESI-MS m/z 421 [M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz) δ:0.73(3H, s, CH3-20), 0.97(3H, d,J=6.8 Hz, CH3-19), 1.03(3H, d,J=6.4 Hz, CH3-18), 1.55(3H, s, CH3-16), 1.59(1H, dd,J=13.6, 5.6 Hz, H-11), 1.73(1H, brs, H-3), 1.75(1H, brs, H-13), 1.82(3H, d,J=6.4 Hz, CH3-13′), 1.83(3H, d,J=6.4 Hz, CH3-6), 1.86(1H, m, H-3″), 2.04(1H, ddd,J=14.0, 9.6, 3.2 Hz, H-2), 2.05(3H, s, OCOCH3), 2.06(3H, s, OCOCH3), 2.31(1H, dd,J=13.6, 7.6 Hz, H-11′), 2.76(1H, brd,J=7.2 Hz, H-17), 2.83(1H, dt,J=14.0, 5.2 Hz, H-2′), 2.92(1H, dd,J=14.4, 11.20 Hz, H-6′), 3.28(1H, s, OH-14), 3.49(1H, s, H-4), 3.80(1H, d,J=7.6 Hz, OH-4), 4.81(1H, brs, H-15), 4.93(1H, brs, H-15′), 5.81(1H, dd,J=7.6, 6.0 Hz, H-10), 5.89(1H, dd,J=11.2, 7.2 Hz, H-7);13C-NMR(CDCl3, 100 MHz) δ: 170.91(OCOCH3), 170.31(OCOCH3), 151.21(C-1), 145.65(C-8), 144.45(C-9), 110.28(C-15), 80.60(C-10), 80.22(C-4), 77.99(C-14), 67.57(C-7), 51.10(C-11), 49.46(C-13), 49.05(C-12), 42.83(C-5), 34.10(C-6), 30.32(C-3), 28.03(C-16), 26.97(C-17), 26.40(C-2), 22.59(C-18), 21.67(OCOCH3), 21.64(OCOCH3), 19.75(C-19), 18.04(C-20)。與文獻(xiàn)[14]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物9為Amijiol-7, 10-diacetate，見圖9。

2.2.10 化合物10 白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)mp 133.0～134.5℃，易溶于甲醇。 ESI-MS m/z 427 [M+H]+。1H-NMR(CDCl3, 400 MHz) δ: 0.73(3H, s, CH3-30), 0.78(3H, s, CH3-18), 0.83(3H, d,J=6.6 Hz, CH3-21), 0.85(3H, s, CH3-28), 0.92(3H, s, CH3-19), 0.98(3H, brs, CH3-29), 1.57(3H, s, CH3-26), 1.67(3H, s, CH3-27),3.24(1H, dd,J=4.6, 2.4 Hz, H-3), 5.08(1H, m, H-24)；13C-NMR(CDCl3, 100 MHz) δ: 134.07(C-8), 133.52(C-9), 130.61(C-25), 125.13(C-24), 78.91(C-3), 50.03(C-5), 50.01(C-17), 49.70(C-14), 44.15(C-13), 38.71(C-4),37.26(C-10),35.74(C-1), 35.49(C-20), 35.31(C-22), 30.93(C-15), 29.78(C-16), 28.04(C-7), 28.00(C-2), 27.91(C-29), 25.61(C-12), 24.94(C-23), 24.80(C-26), 24.38(C-28), 20.12(C-6), 18.97(C-21), 18.84(C-19), 18.69(C-11), 17.60(C-27), 15.65(C-18), 15.50(C-30)。與文獻(xiàn)[15]的數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物10為羊毛甾醇(lanosterol)，見圖10。

3 討論

大戟屬(Euphorbia)是大戟科(Euphorbiaceae)中最大的屬，全球約有2 000多種植物，主要分布于非洲和南美洲，我國約有80余種，主要分布于西南橫斷山區(qū)和西北地區(qū)[15]。大戟屬植物主要成分為脂肪酸類、黃酮類、萜類、甾體類等化學(xué)成分[16]，多樣的化學(xué)成分使其具有多種藥理活性，如抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤以及神經(jīng)生長因子促進(jìn)等作用[17]，但對(duì)皮膚和胃腸道黏膜有強(qiáng)烈的刺激性。眾多學(xué)者對(duì)該屬植物化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)許多結(jié)構(gòu)新穎的新骨架和新化合物。李玉林等[18]首次從藏藥大果大戟丙酮提取物中分離得到巨大戟烷型二萜酯類、單萜二糖苷類等化合物；Shi等[19]從甘青大戟(E.micractina)中分離得到的甘青大戟醇A-C型二萜均為具有新穎骨架的化合物；Shi等[20]從月腺大戟中分離得到一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體的松香烷型二萜，并通過X射線衍射技術(shù)確定了其立體構(gòu)型。本研究從大戟脂中分離得到10個(gè)化合物，其中methyl (20R)-3β-acetoxychol-5-en-24-oate(1)、ergosta-7,22-diene-3-one(2)、鄰苯二甲酸二丁酯(3)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(4)、3-oxolanost-9(11)-ene-24S,25-diol(8)和羊毛甾醇(10)為首次從大戟脂中分離得到，為大戟脂化學(xué)成分的深入研究奠定了基礎(chǔ)，為闡明大戟脂的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。