姚 欣， 黎彧利， 朱艮苗

(重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院檢驗科， 重慶 401320)

結核病( Tuberculosis，TB) 是對人類健康最具威脅性和挑戰(zhàn)性的感染性疾病之一，是各國關注的嚴重公共衛(wèi)生問題[1]。世界衛(wèi)生組織稱，2015年全世界報告了1 040萬新結核病例[2]。隨著治療藥物的應用，結核分枝桿菌出現(xiàn)耐藥性的現(xiàn)象越來越多，其獲得耐藥性有2個主要因素：一為獲得性基因突變，二為外排泵的激活。常見的結核耐藥相關基因有利福平相關(rpoB)、異煙肼相關(katG、inhA)、乙胺丁醇相關(embABC)、吡嗪酰胺相關(pncA)、鏈霉素相關(rpsL、rrs)、氟喹諾酮相關(gyrA、gyrB)。檢測方法主要有 Xpert MTB/RIF 檢測系統(tǒng)、探針雜交技術和高分辨率熔解曲線技術等[3]。本研究利用高分辨率熔解曲線(HRM)技術分析結核病患者耐藥性，旨在為獲得更準確更快速的臨床檢驗報告提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本采集選取2017年1月-2018年6月重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院確診為肺結核病的患者痰樣本250份?；颊咂骄挲g為(52.4±14.2)歲，其中男性185例，女性65例，所有患者均為初治。按照臨床檢驗操作規(guī)程留取合格痰標本。

1.2 涂片鏡檢根據(jù)人民衛(wèi)生出版社第5版《臨床微生物學檢驗》[4]規(guī)定在100個觀察視野中存在1～9個分枝桿菌為1+；10個觀察視野中存在1～9個分枝桿菌為2+；每個觀察視野中存在1～9個分枝桿菌為3+；每個觀察視野中存在>9個分枝桿菌為4+。

1.3 細菌培養(yǎng)將痰標本用4% NaOH處理20～30 min，以去除雜菌。將處理后的標本接種于羅琴培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8周，觀察出現(xiàn)典型灰白色顆粒狀、干燥的菌落且抗酸染色為陽性者為培養(yǎng)成功。

1.4 細菌耐藥性從固體培養(yǎng)基上的分枝桿菌中分離菌株，在肉湯中進行接種，并在37℃下孵育7 d。細菌生長后，在鹽水吐溫-80溶液中制備稀釋液，并用Middlebrook 7H10培養(yǎng)基鋪板，在37℃下培養(yǎng)21 d。異煙肼(INH)使用0.2 μg/ mL和1.0 μg/mL的濃度，利福平(RIF)使用1.0 μg/mL的濃度。通過計數(shù)對照板(H37Rv)上的菌落對含有藥物的平板進行平板讀數(shù)。耐藥百分比 =(含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù))/(對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù))×50%。若耐藥百分比≥1%，則認為受試菌對該藥耐藥(R)，<1%判斷為敏感(S)。

1.6 熔解曲線分析引物序列如表1所示。在以下條件進行實時PCR(Rotor Gene Q，德國 QIAGEN 公司)：95℃變性10 min，95℃1 min，55℃30 s，72℃ 1 min，共40個循環(huán)，最后在72℃下延伸7 min。高分辨率熔解曲線分析在55℃～85℃的溫度范圍進行，增量為0.02℃。將H37Rv菌株的DNA用作參照，并在實時PCR后分析解鏈曲線，以鑒定與rpoB、katG和inhA啟動子區(qū)域基因中的RIF和INH抗性相關的突變區(qū)域。具有與H37Rv類似的分化曲線譜的痰樣品被認為對特定藥物敏感。相反，具有除H37Rv之外的分化曲線譜的痰樣品被認為對特定藥物具有抗性。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學分析應用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,評估熔解曲線分析的靈敏度、特異性、陽性預測值(PPV)和陰性預測值(NPV)并制成四格表。

2 結果

2.1 表型特征及耐藥性根據(jù)涂片鏡檢的分枝桿菌數(shù)量，將樣本分為4類：1+21份，2+72份，3+76份，4+81份，單藥耐藥和多藥耐藥性結果見表2。

表2 表型特征及耐藥性/例

注：MDR為多藥耐藥。

2.2 耐藥熔解曲線分析在具有已知表型譜的250個痰標本中，發(fā)現(xiàn)99個圖譜與對照有差異，為RIF耐藥，101個圖譜與對照有差異，為INH耐藥。觀察到的分化曲線具有敏感和耐藥部分(圖1)。

2.3 熔解曲線與瓊脂平板對耐藥性分析結果高分辨率熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)對RIF耐藥99例，INH耐藥101例，MDR 89例。藥敏試驗結果顯示RIF耐藥93例，INH耐藥102例，MDR 69例(表3)。高分辨率熔解曲線診斷RIF耐藥、INH耐藥和MDR耐藥的靈敏度分別為90.3%、90.2%、89.9%，特異性為90.4%、93.9%、90.6%。

表3 熔解曲線與瓊脂平板對耐藥性分析/例

注：R：耐藥；S：敏感；HRM：高分辨率熔解曲線；RIF：利福平；INH：異煙肼；MDR：多重耐藥。

2.4 涂片結果與HRM分析多重耐藥性的關系根據(jù)涂片鏡檢的結果將涂片分級，分級后的HRM對多重耐藥性的診斷靈敏度、特異性、PPV、NPV結果見表4。對于涂片為4+的標本，HRM診斷的靈敏度、特異性、PPV和NPV均最高，而1+最低，說明細菌數(shù)量越多，HRM診斷多重耐藥性越可靠。

表4 MDR檢測的熔解曲線和瓊脂平板比例分析中的診斷參數(shù)

注：HRM為高分辨率熔解曲線，APP為瓊脂平板。

3 討論

本研究利用高分辨率熔解曲線檢測痰液中結核分枝桿菌的耐藥性,結果顯示，對于單藥RIF或INH的耐藥性分析的靈敏度和特異性均高于90%，而對于多重耐藥性的診斷則此參數(shù)稍有下降?？赡茉蚴菍τ趩蝹€藥物的耐藥性分析時，高分辨率熔解曲線有明確的對照比較，通過圖譜清晰區(qū)分耐藥個體，而其中有假陽性或假陰性的存在，所以在預測多重耐藥性時，假陰性和假陽性的疊加，使得多重耐藥MDR型診斷的靈敏度和特異性比單獨基因型低。由本研究結果可知，多重耐藥MDR型的靈敏度與特異性分別為89.9%和90.6%，因此對于多重耐藥性的診斷也具有一定的可靠性和實用性。

本研究觀察到不同涂片的結果與其HRM分析的靈敏度、特異性、PPV和NPV也有所不同。與涂片1+、2+和3+相比，4+樣本的敏感性和特異性更高。楊彩虹等[5]研究結果顯示，高分辨率溶解曲線用于結核分枝桿菌對異煙肼耐藥性的檢測具有較好的靈敏度，耗時短，在異煙肼耐藥結核病的快速診斷方面具有一定的應用價值，與本研究結果基本一致。本研究在此基礎上，進一步細化了對于不同涂片結果，高分辨率熔解曲線診斷耐藥性的靈敏度與特異性等。對于涂片結果菌數(shù)較多的標本，利用高分辨率熔解曲線可以快速準確地確定耐藥結果，從而提高診斷效率；對于涂片菌數(shù)較少的標本，不建議將高分辨率熔解曲線分析做首選，應以傳統(tǒng)藥敏試驗為主，而高分辨率熔解曲線可作為輔助診斷。基于rpoB、katG基因和inhA啟動子區(qū)域進行高分辨率熔解曲線分析診斷結核桿菌多重耐藥性可作為篩選試驗。

在國內(nèi)外已經(jīng)使用商業(yè)試劑盒基因型MTBDRplus的分子方法，其結合了常規(guī)多重PCR和硝酸纖維條帶中的反向雜交，但該方法復雜[6]。在分子方法中，其他方法的成本較高，因此熔解曲線的分析是診斷的理想選擇。 通過實時PCR在痰樣品中進行MDR-TB，不但可以在24 h內(nèi)進行實驗結果回報并且成本低廉，結果也易于解釋。

Galarza等[7]研究顯示，MDR-TB檢測靈敏度和特異性大于90%，并發(fā)現(xiàn)與rpoB、katG和inhA基因相關的最常見突變是S531L、S315T1和C-15T。Tavakkoliamol等[8]通過熔解曲線分析了2 000份陽性痰標本，發(fā)現(xiàn)點突變檢測靈敏度為98.6%，特異性為100.0%，與本研究結果相似。 Anthwal等[9]分析了124份痰標本，在基因rpoB、katG和啟動子區(qū)域inhA其敏感度分別為89.0%、85.0%、100.0%，所有基因的特異性均為100.0%。

DNA質量影響敏感性和耐藥性熔解曲線的區(qū)分。 與傳統(tǒng)方法(例如樣品煮沸或基于樹脂的純化)相比，用商業(yè)試劑盒純化DNA能夠充分地區(qū)分敏感性和耐藥性2種熔解曲線[10-13]。此外，從痰液樣品中提取的DNA，往往包含結核分枝桿菌以及人體中的DNA，因此有必要對DNA進行優(yōu)化。

總之，熔解曲線的分析對痰標本中MDR-TB的快速診斷具有較高的靈敏性和特異性，能夠基于特定基因鑒定抗藥性突變。使用該方法作為結核病耐藥型診斷的附加篩查試驗，成本低、易于解釋，且需要較少的診斷時間。