李海麗， 劉永太， 張峰波， 李玉嬌， 李智偉， 趙 驍， 丁劍冰,4, 王紅英

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一臨床醫(yī)學(xué)院, 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 烏魯木齊 830011; 3阿克蘇市兵團(tuán)第一師醫(yī)院檢驗(yàn)科， 新疆 阿克蘇 843000;4省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011)

細(xì)粒棘球蚴病(cystic echinoccosis, CE)是一種由細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus, Eg)幼蟲引起的人獸共患病，隨著世界畜牧業(yè)的發(fā)展不斷擴(kuò)散[1]該病呈全球分布，而中國更是CE高發(fā)的國家之一，主要分布在新疆北部、青海以及寧夏等地區(qū)[2]。細(xì)粒棘球蚴病在早期不易被發(fā)現(xiàn)，潛伏期長，發(fā)展到后期會給人類生產(chǎn)、生活造成極大危害[3]。目前包蟲囊腫的主流治療方案是通過外科手術(shù)摘除囊腫，不宜進(jìn)行手術(shù)的患者則通過大劑量甲苯咪唑控制囊腫生長[4]。然而，包蟲病的術(shù)后復(fù)發(fā)率高且治療作用有限，所以疫苗預(yù)防是細(xì)粒棘球蚴病最經(jīng)濟(jì)有效的治療方法[5]。

多年來國內(nèi)外學(xué)者在細(xì)粒棘球蚴病的免疫學(xué)和疫苗研制方面開展了大量工作。Lightowlers等[6]在1993年研制出了抗細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵感染的基因工程重組抗原疫苗，命名為Eg95。Eg95是目前應(yīng)用最廣泛的抗細(xì)粒棘球蚴病的疫苗，在新西蘭、澳大利亞和阿根廷的預(yù)防效果較好，但是在亞洲中部和中國西北部地區(qū)并不能發(fā)揮理想的作用[7-8]。因此，科研工作者希望能夠開發(fā)出高效且特異性高的疫苗來抵抗細(xì)粒棘球蚴病。

前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴病抗原egG1Y162的基因序列、氨基酸序列與蛋白結(jié)構(gòu)都與多房棘球蚴的候選疫苗EmY162存在高度相似的情況[9]?；谥亟M抗原EmY162對終末宿主的良好保護(hù)作用，以及重組卡介苗(BCG)活體疫苗載體的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室在egG1Y162抗原的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了rBCG-egG1Y162菌株，即將egG1Y162抗原基因克隆到大腸埃希菌-分枝桿菌的穿梭表達(dá)載體pMV361中，再通過電轉(zhuǎn)法將攜帶目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BCG中，從而誘導(dǎo)表達(dá)BCG-egG1Y162重組蛋白[10-11]。在此基礎(chǔ)上，希望通過研究重組抗原蛋白BCG-egG1Y162免疫小鼠后對機(jī)體免疫力的影響，評價(jià)小鼠的相關(guān)體液免疫、細(xì)胞免疫指標(biāo)，以及抗細(xì)粒棘球蚴感染的能力，來為CE的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6～8周BALB/c雌性小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)研究部提供。

1.1.2 細(xì)粒棘球蚴原頭蚴 從新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科包病蟲患者手術(shù)摘除的完整包囊中無菌條件抽取囊液，分離原頭蚴，用生理鹽水配制成1.5×104個(gè)原頭蚴/mL，用于感染BALB/c雌性小鼠。

1.1.3 細(xì)粒棘球重組蛋白BCG-egG1Y162 由本室提供。將egG1Y162抗原基因克隆到大腸埃希菌-分枝桿菌的穿梭表達(dá)載體pMV361中，再通過電轉(zhuǎn)法將攜帶目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BCG中，從而誘導(dǎo)表達(dá)BCG-egG1Y162重組蛋白[12]。

1.1.4 主要試劑 大腸埃希菌-分支桿菌穿梭質(zhì)粒pMV361和BCG由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院張萬江教授惠贈；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、刀豆蛋白A (ConA)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購買自華美生物工程公司；IL-4、IFN-γ的ELISA檢測試劑盒購買自福麥斯公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑(IFA)購買自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購買自Gibico公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫接種 隨機(jī)將BALB/c雌性小鼠分成3組，每組20只，A組為BCG-egG1Y162免疫組，B組為重組卡介苗組(BCG組)，C組為正常組(生理鹽水對照組)。A組即免疫組小鼠，在小鼠背部多點(diǎn)皮下注射200 μL重組蛋白BCG-egG1Y162(25 μg/μL，重組蛋白用PBS溶解后加等體積FCA乳化)，先后共免疫4次，后3次加強(qiáng)免疫時(shí)間間隔為2周；B組為BCG組，小鼠背部多點(diǎn)注射100 μL BCG+100 μL FCA，免疫次數(shù)和間隔時(shí)間同A組。A、B2組首次免疫用完全弗氏佐劑，后3次加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑；C組為正常組，背部多點(diǎn)皮下注射生理鹽水200 μL /只/次。在免疫的第0、2、4、6、8、32周通過毛細(xì)管進(jìn)行眼底靜脈叢取血，離心機(jī)預(yù)冷至4℃，外周血2 000 r/min離心10 min獲得血清，置于-80℃冰箱中保存。在免疫的第8周，每組隨機(jī)處死10只小鼠用于分離脾淋巴細(xì)胞，剩下的10只小鼠用于體內(nèi)抗活棘球蚴原頭蚴感染實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ELISA法檢測血清中IgG的水平 采用ELISA法檢測各組0、2、4、6、8、32周的血清中IgG抗體水平的動態(tài)變化。用包被液稀釋BCG-egG1Y162調(diào)整濃度至10 μg/mL，按100 μL加入到酶標(biāo)板各孔中，置于4℃層析柜中包埋過夜。次日用PBS-0.5%Tween洗板3次，5%脫脂奶粉封閉2 h封閉非特異性位點(diǎn)。棄去封閉液后重復(fù)洗板步驟，再加入按1:200的稀釋比稀釋各組血清，100 μL /孔37℃孵育2 h，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。重復(fù)洗板3次后，加入1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 100 μL/孔，37℃孵育2 h。PBS-0.5%Tween洗板3次，加入TMB顯色15 min，用50 μL /孔的H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取450 nm處各孔吸光度(OD值)。

1.2.3 脾細(xì)胞懸液的制備 在免疫的第8周每組隨機(jī)處死10只BALB/c小鼠，置75%乙醇中消毒5 min。超凈臺中解剖取脾臟，勻漿，用2 mL PBS沖洗，200目尼龍膜過篩，濾液加入10倍體積的紅細(xì)胞裂解液，2 000 r/min 離心5 min。PBS洗3次，2 000 r/min 離心5 min，棄去上清。用RPMI1640調(diào)整密度至5×106/mL。臺盼藍(lán)染色顯示脾細(xì)胞存活率達(dá)到95%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 BCG-egG1Y162刺激后脾淋巴細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4水平的測定 將濃度為5×106/mL的各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入10 μg/mL的BCG-egG1Y162重組抗原蛋白刺激72 h，以未加刺激因子的脾淋巴細(xì)胞組為空白對照，均重復(fù)6孔，細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。結(jié)束后收集脾細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心15 min獲取細(xì)胞上清液，用IFN-γ、IL-4試劑盒分別檢測小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-4的含量水平，來更進(jìn)一步的探討B(tài)CG-egG1Y162誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中是細(xì)胞免疫還是體液免疫發(fā)揮主要作用。

1.2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn) 將調(diào)整好濃度的各組小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別用5 μg/mL ConA以及10 μg/mL BCG-egG1Y162刺激72 h，以未加刺激因子的脾淋巴細(xì)胞組為空白對照，均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入20 μL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間。結(jié)束后2 000 r/min離心8 min，棄去上清，加入100 μL二甲基亞砜低溫振蕩10 min，輕輕反復(fù)吹打至甲簪充分溶解，測定樣本在570 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.6 活棘球蚴原頭蚴感染小鼠和免疫保護(hù)力的測定 在第8周時(shí)，A、B、C3組小鼠腹腔注射活棘球蚴原頭蚴1500枚/只，在第32周(感染后24周)處死小鼠，打開腹腔，對各組小鼠腹腔內(nèi)包囊個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并測量包囊直徑，根據(jù)公式計(jì)算出各組小鼠的免疫保護(hù)力，免疫保護(hù)力(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均包囊數(shù)/正常組平均包囊數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 BCG-egG1Y162免疫小鼠后血清中IgG動態(tài)觀察ELISA法檢測各組小鼠血清中抗體IgG在第0、2、4、6、8周的OD值水平，結(jié)果如表1所示。BCG-egG1Y162免疫組血清中IgG抗體從第4周開始表現(xiàn)為陽性，并且持續(xù)增長，在第8周達(dá)到最高水平。經(jīng)分析，BCG-egG1Y162免疫組IgG水平從第4周開始就顯著高于第0周，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；從第4周直到第8周，BCG-egG1Y162免疫組的IgG水平與同一時(shí)間的BCG組和正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BCG組和正常組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見表1。

表1 BCG-egG1Y162免疫小鼠后血清中IgG動態(tài)觀察(OD Value, ±s)

注： 與正常組或BCG組相比,*P<0.05。

2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果將A、B、C3組小鼠脾淋巴細(xì)胞分別與ConA、重組蛋白BCG-egG1Y162共同培養(yǎng)，另外設(shè)置未加刺激物的組別作為對照，MTT法檢測3種培養(yǎng)條件下的各組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ConA刺激可使3組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力得到明顯提高，與同組未加刺激物相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明各組小鼠脾淋巴細(xì)胞在ConA的刺激下均有增殖能力。但BCG-egG1Y162免疫組、正常組、BCG組3組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用重組蛋白BCG-egG1Y162刺激脾淋巴細(xì)胞后，BCG-egG1Y162免疫組脾淋巴細(xì)胞與BCG組和正常組相比明顯增加(P<0.05)，與同組無刺激物相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。并且BCG組和正常組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示BCG-egG1Y162免疫組的脾淋巴細(xì)胞在體外能被BCG-egG1Y162蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的免疫記憶能力，能夠被特異性的刺激增生，誘生一定水平的細(xì)胞免疫。

2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4的誘生和測定結(jié)果在BCG-egG1Y162免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞上清液中，IFN-γ、IL-4的表達(dá)量以及IFN-γ/IL-4的比值顯著高于正常組和BCG組(P<0.05)。IFN-γ、IL-4的表達(dá)量及其IFN-γ/IL-4比值在正常組和BCG組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表3。由此可見，重組蛋白BCG-egG1Y162具有免疫原性，并且顯著增強(qiáng)了小鼠的脾淋巴細(xì)胞的Th1/Th2免疫反應(yīng)，平衡偏向Th1反應(yīng)，即細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位。

表2 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平(OD Value, ±s)

注： 與正常組或BCG組相比,*P<0.05。

表3 小鼠脾淋巴細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4的水平及其比值

注： 與正常組或BCG組相比,*P<0.05。

2.4 小鼠感染活棘球蚴原頭蚴后血清中IgG水平檢測ELISA法檢測各組小鼠感染活棘球蚴原頭蚴后血清中的IgG的OD值水平，如表4所示。BCG-egG1Y162免疫組在感染活棘球蚴原頭蚴后的第24周(免疫后第32周)時(shí)，小鼠血清中的IgG水平相對于感染第8周有所下降，與第0周相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且顯著高于同一時(shí)間的BCG組和正常組(P<0.05)。BCG組和正常組在感染后第24周的小鼠血清中的IgG水平與第0周和第8周相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組在同一時(shí)間的IgG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 BCG-egG1Y162免疫小鼠感染活棘球蚴原頭蚴后血清中IgG水平(OD Value, ±s)

注： 與正常組或BCG組相比,*P<0.05。

2.5 小鼠的抗活棘球蚴原頭蚴感染能力檢測結(jié)果A、B、C3組小鼠腹腔內(nèi)注射活棘球蚴原頭蚴1 500枚/只，在感染后第24周(免疫后第32周)處死，計(jì)數(shù)各組小鼠包囊個(gè)數(shù)以及直徑。發(fā)現(xiàn)BCG-egG1Y162免疫小鼠體內(nèi)的包囊數(shù)及包囊大小與BCG組和正常組相比明顯減少和縮小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BCG組和正常組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相比于正常組，發(fā)現(xiàn)BCG-egG1Y162可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生87.1%的免疫保護(hù)力抵抗活棘球蚴原頭蚴的感染，BCG組的免疫保護(hù)力為8.02%，見表5。

表5 各組小鼠產(chǎn)生的包囊數(shù)及免疫保護(hù)力

注： 與正常組或BCG組相比,*P<0.05。

3 討論

細(xì)粒棘球蚴病是一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，是當(dāng)前國家衛(wèi)生部規(guī)劃防治的重要寄生蟲病之一。近年來隨著人口流動的增加以及畜牧業(yè)的發(fā)展，細(xì)粒棘球蚴病不斷地蔓延和擴(kuò)散[13]。因此，提高防治工作的力度刻不容緩。相對于外科手術(shù)以及藥物治療帶來的高復(fù)發(fā)率和副作用，抗原疫苗的出現(xiàn)為CE的防治開辟了一條新途徑?？乖呙缤ㄟ^加強(qiáng)機(jī)體自身的免疫應(yīng)答來抵抗細(xì)粒棘球蚴病，高效且具有特異性，值得進(jìn)一步探究[14]。本實(shí)驗(yàn)希望通過研究重組蛋白BCG-egG1Y162對機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)揮的作用，來為細(xì)粒棘球蚴病的防治工作提供一定幫助。

目前一些研究表明體液免疫和細(xì)胞免疫在機(jī)體抵抗細(xì)粒棘球蚴感染中均發(fā)揮了重要作用[15]。在體液免疫方面，IgG是全身性體液免疫分子的效應(yīng)因子，在抗感染中發(fā)揮中和毒素以及調(diào)理等作用，所以能在一定程度上反映了機(jī)體體液免疫的水平[16]。BCG-egG1Y162免疫組小鼠血清中IgG抗體水平從第2周開始逐漸上升，在第8周達(dá)到最高水平，從第4周開始其IgG水平與正常組和BCG組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明BCG-egG1Y162可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，說明BCG-egG1Y162具有較好的免疫原性。

而在細(xì)胞免疫中，T淋巴細(xì)胞是機(jī)體非常關(guān)鍵的活性免疫細(xì)胞之一，T淋巴細(xì)胞的增殖和分化是免疫應(yīng)答過程中的一個(gè)重要階段，通過檢測脾T淋巴細(xì)胞的增殖水平來反映其功能的高低是評價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的常用方法[17]。通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，BCG-egG1Y162免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞在重組蛋白BCG-egG1Y162的刺激下，其數(shù)目遠(yuǎn)高于BCG組和正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在ConA的刺激下，免疫組、正常組和BCG組的脾淋巴細(xì)胞雖然均表現(xiàn)出明顯增殖，但是3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推測BCG-egG1Y162免疫可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生較好的記憶能力，在體外能被重組蛋白BCG-egG1Y162特異性刺激增生從而產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。

BCG-egG1Y162可誘導(dǎo)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為了進(jìn)一步探究在是何種應(yīng)答方式在BCG-egG1Y162誘導(dǎo)的抗細(xì)粒棘球蚴感染的過程中占主導(dǎo)地位，本研究通過ELISA法檢測BCG-egG1Y162免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4的水平并比較兩者的比值。其中IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌產(chǎn)生，介導(dǎo)細(xì)胞免疫。而IL-4由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)體液免疫。有研究表明，IFN-γ促進(jìn)Th0向Th1分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答使體液免疫應(yīng)答降低[18]。IL-4則是促進(jìn)Th0向Th2分化，增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答的同時(shí)對細(xì)胞免疫起下調(diào)作用[19]。郭忠?guī)浀萚20]研究發(fā)現(xiàn)，CE患者術(shù)后血清中IFN-γ表達(dá)上調(diào)，是因?yàn)殡S著包囊的切除，相應(yīng)抗原的減少，宿主體內(nèi)免疫應(yīng)答逐漸恢復(fù)，機(jī)體通過分泌IFN-γ來抵抗細(xì)粒棘球蚴感染。所以IFN-γ/IL-4比值反映了Th1/Th2的平衡偏向，即免疫應(yīng)答中是體液免疫還是細(xì)胞免疫占據(jù)優(yōu)勢。本研究結(jié)果顯示，IFN-γ、IL-4以及IFN/IL-4比值均顯著性高于正常組和BCG組，說明在BCG-egG1Y162誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，細(xì)胞免疫發(fā)揮主要作用。

在BCG-egG1Y162誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)抗細(xì)粒棘球蚴感染實(shí)驗(yàn)中，BCG-egG1Y162免疫組的小鼠在感染細(xì)粒棘球蚴后IgG水平顯著高于正常組和BCG組，說明BCG-egG1Y162免疫小鼠能增強(qiáng)其抗細(xì)粒棘球蚴感染能力。為了進(jìn)一步探究BCG-egG1Y162的抗感染能力，本研究計(jì)數(shù)感染后24周的各組小鼠的包囊個(gè)數(shù)，并比較包囊直徑大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCG-egG1Y162免疫組的小鼠的包囊數(shù)目和大小與正常組和BCG組相比較明顯減少和縮小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以正常組為陰性對照，BCG-egG1Y162免疫組小鼠的免疫保護(hù)力達(dá)到了87.1%，明顯高于BCG組的8.02%，所以BCG-egG1Y162能誘導(dǎo)小鼠抗細(xì)粒棘球蚴感染，可成為細(xì)粒棘球蚴病的候選疫苗。

綜上所述，細(xì)粒棘球蚴重組抗原蛋白BCG-egG1Y162免疫小鼠可上調(diào)小鼠血清中IgG的水平并刺激脾淋巴細(xì)胞增殖活化，特異性的增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的Th1免疫反應(yīng)，減少感染小鼠包囊的發(fā)生。所以重組蛋白能夠有效地誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的發(fā)生，通過增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮抗細(xì)粒棘球蚴感染的作用，其中細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮主要作用。說明BCG-egG1Y162是具有研究價(jià)值的細(xì)粒棘球蚴病候選疫苗分子，能為細(xì)粒棘球蚴病的防治工作帶來幫助。