劉濟(jì)銘，潘 桃，全 瑤

(重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院急診科 402760)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是乳腺癌患者的重要預(yù)后指標(biāo)，其過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖快，容易復(fù)發(fā)，約有30%的乳腺癌患者合并HER2基因的過表達(dá)和擴(kuò)增[2]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)有別于其他T淋巴細(xì)胞，該亞群能參與自身免疫性疾病的發(fā)展過程，同時(shí)還擁有免疫耐受功能[3]。胃腺癌患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞表達(dá)明顯增加[4]。此外，Treg還通過分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[5]。本研究擬觀察Treg細(xì)胞在HER2陽性乳腺癌患者中的表達(dá)情況，并且探討Treg細(xì)胞在HER2陽性乳腺癌中發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1乳腺癌患者標(biāo)本來源 標(biāo)本來源于本院2015年1月至2017年6月HER2陽性乳腺癌患者共70例，所有病例均為女性，年齡26～70歲(中位年齡46歲)。術(shù)前均未進(jìn)行內(nèi)分泌、化療、放療等治療，所有標(biāo)本均為熒光原位雜交法(FISH)/顯色原位雜交法(CISH)檢測(cè)后并確定為HER2陽性乳腺癌。

1.1.2試劑來源 刀豆蛋白A(ConA)購自美國(guó)Sigma公司，EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自銳博(Ribo)公司，人淋巴細(xì)胞分離液購自美國(guó)TBD公司；多甲藻黃素-葉綠素蛋白-花青素5.5(peridinin chlorophyll protein-cyanin 5． 5，PerCPCy5.5)標(biāo)記的抗人CD3，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人CD4，別藻青蛋白(APC)標(biāo)記的抗人CD25，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗人FoxP3，人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自四正柏公司。

1.2方法

1.2.1分組 抽取健康獻(xiàn)血者、HER2陽性未轉(zhuǎn)移乳腺癌患者、HER2陽性轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的靜脈血，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，3 000 r/min梯度離心，吸取中間白色層細(xì)胞，即為外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用完全培養(yǎng)基重懸PBMC，以2×105/孔種入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并將接種細(xì)胞分為對(duì)照組、HER2陽性未轉(zhuǎn)移乳腺癌組、HER2陽性轉(zhuǎn)移乳腺癌組。各組均加入ConA進(jìn)行處理。

1.2.2EdU檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞于培養(yǎng)結(jié)束前12 h加入EdU試劑，繼續(xù)培養(yǎng)至60 h；按EdU試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后將收集的細(xì)胞加入100 μL Apollo反應(yīng)液，孵育30 min后棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的比例 收集培養(yǎng)至60 h的各組細(xì)胞，分別取2×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。于各組細(xì)胞中分別加入5 μL的APC標(biāo)記的抗人 CD25、FITC 標(biāo)記的抗人CD4，避光染色30 min，用多聚甲醛固定5 min后加入破膜劑處理7 min，加入5 μL PE 標(biāo)記的抗人FoxP3，室溫避光染色30 min，用PBS重懸后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)每組細(xì)胞FoxP3 mRNA的表達(dá)情況 收集培養(yǎng)至60 h的各組細(xì)胞，用RNA試劑盒提取各組細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，擴(kuò)增條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循環(huán)40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，引物由Primier6.0軟件設(shè)計(jì)。GAPDH的上游引物5′-TGA TTC TAC CCA CGG CAA GTT-3′，下游引物：5′-TGA TGG GTT TCC CAT TGA TGA-3′；FoxP3的上游引物：5′-GAG AAG CTG AGT GCC ATG CA-3′；下游引物：5′-AGA GCC CTT GTC GGA TGA T-3′，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用2-△△Ct方法進(jìn)行分析。

1.2.5PBMC中樹突狀細(xì)胞(DC)檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，首先挑選出CD11c和人類白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)雙陽性的細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上挑選出CD11c和CD123雙陽性的細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上選出CD86陽性的細(xì)胞，即為本次研究的DC細(xì)胞。于各組細(xì)胞內(nèi)加入5 μL PE-Cy7標(biāo)記人CD86抗體、PE標(biāo)記人HLA-DR抗體、APC標(biāo)記人CD123抗體、FITC標(biāo)記人CD11c抗體，4 ℃避光孵育30 min。同時(shí)設(shè)同型對(duì)照，孵育完后用PBS洗滌棄上清液，用150 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以未處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.2.6ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞IL-10和TGF-β的表達(dá)情況 收集培養(yǎng)至60 h的細(xì)胞上清液，凍存于-80 ℃。按ELISA試劑盒說明書分別檢測(cè)TGF-β和IL-10，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度(A)值，讀出數(shù)據(jù)并做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出TGF-β、IL-10水平。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞EdU檢測(cè)結(jié)果 EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過ConA刺激60 h后，3組細(xì)胞均有增殖，說明ConA能顯著刺激各組細(xì)胞的增殖。與對(duì)照組[(1.13±0.32)%]相比，HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組[(15.86±2.00)%]、HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組[(20.96±1.79)%]細(xì)胞增殖明顯(P<0.01)，與HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組相比，HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組細(xì)胞增殖明顯(P<0.01)。見圖1。

A:對(duì)照組；B:HER2 陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組；C:HER2 陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞PBMC增殖情況

2.2各組Treg細(xì)胞比例變化 與對(duì)照組[(2.21±0.37)%]相比，HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組[(7.58 ±0.74)%]和HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組[(10.59±0.68)%]中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例(Q2)占CD4+T細(xì)胞比例明顯升高(P<0.01)；HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例(Q2)占CD4+T細(xì)胞比例明顯高于HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組(P<0.01)。見圖2。

A:對(duì)照組；B:HER2 陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組;C:HER2 陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組

圖2流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的比例

2.3FoxP3 mRNA的表達(dá)情況 以對(duì)照組為參照，HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組(4.15±0.23，P<0.05)、HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組(7.81±0.41，P<0.01)FoxP3 mRNA的表達(dá)水平均顯著增高；而HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組FoxP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。

A:對(duì)照組；B:HER2 陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組;C:HER2 陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組

圖3各組DC表面分子CD86的表達(dá)情況

a:P<0.01，與對(duì)照組比較；b:P<0.01，與HER2 陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組比較

圖4各組細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的含量比較

2.4各組DC的檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組[(70.49±1.22)%]相比，HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組[(30.56±0.82)%]、HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組[(12.00± 0.90)%]CD86分子表達(dá)明顯降低(P<0.01)，與HER2 陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組相比，HER2 陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組能更顯著抑制CD86的表達(dá)(P<0.01)。見圖3。

2.5各組細(xì)胞因子的結(jié)果 HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組、HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組中IL-10、TGF-β的水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移組高于HER2陽性乳腺癌未轉(zhuǎn)移組(P<0.01)。見圖4。

3 討 論

ConA是一種能在體外能活化初始T淋巴細(xì)胞的絲裂原。本研究中采用EdU來檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，這種檢測(cè)方法較磺酸基苯基-3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氫四唑嗡鹽(MTS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)更靈敏、快速、準(zhǔn)確。本次研究中觀察到ConA能明顯刺激PBMC的增殖，在HER2陽性乳腺癌中ConA刺激PBMC增殖更快，提示腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)較正常細(xì)胞生長(zhǎng)更加迅速，從而導(dǎo)致腫瘤治療困難，治療效果不佳。

CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞與Th1和Th2型細(xì)胞有明顯的差異[6]，除了具有維持自身免疫耐受、調(diào)控免疫反應(yīng)強(qiáng)度外，還參與誘導(dǎo)移植耐受、腫瘤免疫逃逸的作用。此類細(xì)胞表面可表達(dá)多種分子，如CD25、Foxp3等[7-8]，而Foxp3是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)識(shí)，是Treg細(xì)胞發(fā)揮作用、分化增殖的重要標(biāo)志，其可以影響細(xì)胞的增殖分化及調(diào)節(jié)功能[7-8]。那么，Treg細(xì)胞在HER2陽性乳腺癌中免疫抑制是否發(fā)揮作用呢？為了解其中的作用關(guān)系，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記Treg細(xì)胞的CD4、CD25和Foxp3以觀察Treg細(xì)胞在HER2陽性乳腺癌中是否有免疫抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ConA能明顯增加HER2陽性乳腺癌中Treg細(xì)胞的比例，而HER2陽性轉(zhuǎn)移乳腺癌中CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比較HER2陽性未轉(zhuǎn)移乳腺癌更高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR也具有類似的結(jié)果：提示HER2陽性乳腺癌患者中Treg細(xì)胞的Foxp3基因表達(dá)明顯升高。因此，可以證實(shí)在HER2陽性乳腺癌患者體內(nèi)Treg細(xì)胞水平明顯高于健康人，F(xiàn)oxp3基因表達(dá)也是明顯升高，提示HER2陽性乳腺癌患者的抑制作用是通過上調(diào)Treg細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，且HER2陽性轉(zhuǎn)移乳腺癌較HER2陽性未轉(zhuǎn)移乳腺癌患者體內(nèi)Treg細(xì)胞表達(dá)更多，因Treg細(xì)胞可以通過兩條途徑：免疫無能和免疫抑制來使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸作用，從而誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫耐受或無應(yīng)答[9]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的瘋狂增殖，因此難以實(shí)現(xiàn)有效的抗腫瘤療效，從而降低患者生存率。

DC是專職抗原提呈細(xì)胞(APC)，功能非常強(qiáng)大，可分為成熟DC和不成熟DC，成熟DC高表達(dá)CD-11c、CD80、MHC分子、CD86、CD40等，其抗原提呈作用、促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用強(qiáng)；而不成熟DC則正好與之相反，其可以通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增加或促使效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闊o能細(xì)胞而引起免疫耐受[10]，因此，DC的成熟度與其表面的抗原提呈分子及表達(dá)的共刺激分子情況有極大的關(guān)系[11]。本研究中選用CD86、CD11c、CD123、組織相容性復(fù)合物(MHC)-Ⅱ來檢測(cè)DC的表型變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HER2陽性乳腺癌中DC表面分子CD86表達(dá)明顯降低，提示HER2陽性乳腺癌可以下調(diào)DC的免疫表型，可能通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增加或促使效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闊o能細(xì)胞而發(fā)揮免疫耐受作用。CD4+CD25+FOXP3+Treg還能通過分泌TGF-β1和IL-10(均為抑制性細(xì)胞因子)來發(fā)揮免疫抑制作用[12-14]。在腫瘤細(xì)胞與PBMC共同培養(yǎng)時(shí)，通過外源性加入TGF-β1可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化增殖，從而發(fā)揮腫瘤的免疫逃逸[15]。IL-10能促使初始T細(xì)胞增殖分化為Treg細(xì)胞，具有強(qiáng)大的抑制細(xì)胞因子生成、抑制免疫細(xì)胞激活的作用。本次試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)TGF-β1、IL-10與CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的變化相一致，即HER2陽性未轉(zhuǎn)移乳腺癌中TGF-β1、IL-10的分泌增多，而HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中TGF-β1、IL-10分泌更多，提示HER2陽性乳腺癌而不論是否轉(zhuǎn)移均可分泌抑制性細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫抑制作用，但轉(zhuǎn)移性乳腺癌較非轉(zhuǎn)移性乳腺癌發(fā)揮免疫抑制作用更強(qiáng)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者免疫抑制作用更強(qiáng)，后期生存率更低。

腫瘤的免疫治療是腫瘤治療過程中非常重要的手段之一。本研究提示在HER2陽性乳腺癌患者中Treg細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，DC的表達(dá)明顯降低，抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)明顯升高，提示HER2陽性乳腺癌患者處于免疫抑制或免疫耐受的狀態(tài)，從而為既往乳腺癌的免疫治療效果不佳的原因提供了最新的解釋。因此，在以后的研究中，尋找能抑制或清除Treg細(xì)胞增殖分化、發(fā)揮免疫抑制作用的新方法將成為提高HER2陽性乳腺癌患者免疫治療效果的新策略。