曾鳳嬌，楊 琳，劉建國，于 航，陳 靖，白國輝

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)口腔學(xué)院，貴州遵義 563000；2.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室,貴州遵義 563000；3.貴陽市口腔醫(yī)院綜合科 550000)

牙周病以其較高的發(fā)生率及危害性影響著1/3成人及超過1/2的65歲以上老年人的牙齒健康，同時與全身的一些系統(tǒng)性疾病也有一定關(guān)系。因此，探尋一種能夠有效預(yù)防和治療牙周病的方法對解決牙周病帶來的各種危害有著重要的現(xiàn)實意義。研究認(rèn)為，牙周病是由寄生菌以菌斑生物膜為主要的存在形式，寄生于口腔及局部微生態(tài)環(huán)境，使一些厭氧致病菌滋生、定植并破壞宿主的細(xì)胞結(jié)構(gòu)引起的[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.g) 利用補(bǔ)體系統(tǒng)誘發(fā)菌群及微環(huán)境失調(diào)，破壞宿主的防御系統(tǒng)而引發(fā)病變，目前普遍認(rèn)為對于慢性牙周病具有明確的致病作用[2]。P.g黏附定植于宿主細(xì)胞，是發(fā)揮破壞作用的基礎(chǔ)。P.g表面含有菌毛、牙齦素、脂多糖、外膜蛋白、血凝素和蛋白酶等大量毒力因子，其中表面重要的致病因子菌毛和牙齦素在P.g的黏附和定植中起重要作用。菌毛蛋白(fimbrillin，F(xiàn)imA)作為菌毛主要的亞單位，是菌毛發(fā)揮黏附作用的重要因子。在口腔環(huán)境中，F(xiàn)imA可通過與宿主細(xì)胞外部分子特異性地結(jié)合來促進(jìn)細(xì)菌的定植，以及與牙菌斑內(nèi)其他菌體表面蛋白相結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)菌斑生物膜成熟而發(fā)揮致病作用。牙齦素作為特異性半胱氨酸蛋白酶，編碼基因分別為rgpA、rgpB和kgp。其中rgpA基因包括血凝集素黏附結(jié)構(gòu)域(hemagglutinin A，HA)和催化結(jié)構(gòu)域。HA基因又分為編碼HA1～4結(jié)構(gòu)域的4段，其中HA2為P.g的關(guān)鍵區(qū)域。有文獻(xiàn)顯示菌毛的表達(dá)可影響牙齦素的合成，而牙齦素亦可通過其蛋白水解活性影響菌毛的成熟，二者在黏附過程中可能是協(xié)同發(fā)揮作用[3]。因此，本實驗選擇聯(lián)合使用FimA和牙齦素抗原基因構(gòu)建的基因疫苗作為免疫原,通過黏膜免疫的方式作用于SD大鼠，觀察其對于SD大鼠牙周炎產(chǎn)生的免疫防御作用。本實驗組前期已經(jīng)成功制備了牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA、pVAX1-HA2-FimA/白細(xì)胞介素(IL)-15[4]。并證實目的基因HA2、FimA在mRNA水平能夠被正確表達(dá)，以及制備了相應(yīng)的蛋白抗原，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等證實目的基因在體外能夠被正確表達(dá)。本次實驗在前期基礎(chǔ)上，通過牙周炎基因疫苗經(jīng)鼻黏膜免疫SD大鼠后，檢測唾液中相關(guān)的特異性抗體水平變化，觀察該基因疫苗的免疫原性。初步探索牙周病基因疫苗免疫防治牙周病的機(jī)制及可行性，同時為下一步牙周炎基因疫苗的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 7周齡的SD雌性大鼠32只，體質(zhì)量150 g左右，購自第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動物室。質(zhì)檢單位：重慶市實驗動物質(zhì)檢中心。許可證號：SCXK (渝)2012-0005。

1.1.2重組質(zhì)粒及主要試劑 牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA、pVAX1-HA2-FimA/IL-15，空載體pVAX1，HA2、FimA抗原為課題組前期構(gòu)建和保存。Goat anti-Mouse IgA Cross-Adsorbed(Thermo公司,美國)；牛血清清蛋白(BSA,Amresco公司，美國)；Secondary Antibody,辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗大鼠IgA(基因有限公司，中國)；戊巴比妥鈉(哈靈生物科技有限公司，中國)；2%硝酸毛果蕓香堿(山東正大福瑞達(dá)制藥有限公司，中國)。

1.2方法

1.2.1主要試劑配制 ELISA相關(guān)試劑配置詳見參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.2實驗動物分組與免疫 32只7周齡雌性SD大鼠平均分組，每組8只。實驗組：A、B組，對照組：C、D組。具體如下：A組pVAX1-HA2-FimA組；B組pVAX1-HA2-FimA/IL-15組；C組pVAX1組；D組生理鹽水組。在第0、7、14天對大鼠進(jìn)行牙周炎基因疫苗免疫，免疫途徑為雙側(cè)鼻黏膜免疫。免疫劑量為200 μg·次-1·只-1(1 μg/μL)，免疫次數(shù)為3次。

1.2.3標(biāo)本采集 唾液標(biāo)本采集時間：免疫前1 d及免疫后每周，連續(xù)收集9周。采集方式：腹腔注射藥物，2%硝酸毛果蕓香堿(0.3 mL/100 g)，約1 min后開始收集唾液，每只收集量約0.5 mL。4 ℃，12 000 r/min離心15 min，棄雜質(zhì)沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4唾液中分泌型IgA(sIgA)抗體水平檢測 采用間接ELISA法。以交叉連續(xù)稀釋分析法確定出酶標(biāo)抗體過氧化酶標(biāo)記羊抗大鼠IgA最佳工作比例為1∶4 000,HA2、FimA抗原最佳包被濃度為2.5 μg/mL；唾液標(biāo)本最佳稀釋比例1∶4。按濃度梯度包被96孔酶標(biāo)板，5% BSA封閉，每孔加入100 μL唾液標(biāo)本[含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)1∶4稀釋]。37 ℃濕盒溫育2 h，加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗大鼠IgA抗體(二抗，1∶4 000),加入底物顯色，酶標(biāo)儀檢測記錄450 nm處吸光度(A450)值。

1.2.5免疫部位目的蛋白的表達(dá)的檢測 免疫后第5周每小組取2只大鼠處死，分離鼻黏膜，固定、包埋，5 μm連續(xù)切片,免疫組織化學(xué)檢測。先進(jìn)行抗原修復(fù)(HA2：0.01 mol/L檸檬酸緩沖液，加熱10.5 min；FimA：0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液，加熱12.0 min)。所用抗體如下：一抗為根據(jù)預(yù)實驗確定的HA2、FimA(1∶200)，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，4 ℃過夜；二抗為HRP標(biāo)記的第二抗體，37 ℃ 20 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液顯色，常規(guī)透明、脫水和封片。

2 結(jié) 果

2.1唾液中特異性抗體檢測唾液中sIgA型抗HA2抗體水平的觀察 第1周開始，實驗組抗體即產(chǎn)生，2～5周逐步上升，第5周達(dá)到高峰；抗體水平從第6周開始下降，第9周逐漸接近免疫前水平。對照組維持較低抗體水平且起伏變化不明顯。B組免疫誘導(dǎo)的唾液sIgA型抗HA2抗體水平比A組高，第8周A組抗體水平接近免疫前，而B組在第9周表現(xiàn)出此現(xiàn)象(圖1、表1)。

2.2唾液中sIgA型抗FimA抗體水平的觀察 免疫第1周，實驗組抗體水平出現(xiàn)升高，2～5周逐步上升，于第5周達(dá)到高峰。第6周開始，抗體平逐漸下降，其中A組下降速度較明顯，第9周抗體水平與免疫前接近。C組及D組維持較低抗體水平且起伏變化不明顯。B組免疫誘導(dǎo)的唾液sIgA型抗FimA抗體水平較A組高(圖2、表2)。

圖1 大鼠唾液中sIgA型抗HA2抗體水平趨勢圖

圖2 大鼠唾液中sIgA型FimA抗體水平趨勢圖

表1 各組SD大鼠唾液中sIgA型抗HA2抗體A450值組間比較P值

表2 各組SD大鼠唾液中sIgA型抗FimA抗體A450值組間比較P值

A：pVAX1-HA2-fimA組；B：pVAX1-HA2-fimA/IL-15組；C：pVAX1組；D：生理鹽水組

圖3HA2蛋白免疫組織化學(xué)定位(×400)

A：pVAX1-HA2-FimA組;B：pVAX1-HA2-FimA/IL-15組;C：pVAX1組;D：生理鹽水組

圖4FimA蛋白免疫組織化學(xué)定位(×400)

2.3鼻黏膜目的蛋白的表達(dá) HA2蛋白在鼻黏膜固有層中黏液性腺泡、腺體及部分巨噬細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見棕黃色目的蛋白的表達(dá)，陽性染色在對照組沒有出現(xiàn)(圖3)。FimA蛋白在鼻黏膜固有層中黏液性腺泡、腺體、骨骼肌、部分巨噬細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中見棕黃色目的蛋白的表達(dá)，陽性染色在對照組沒有出現(xiàn)(圖4)。

3 討 論

自從明確了P.g在牙周炎中產(chǎn)生的影響以來，利用P.g毒力因子的抗原開發(fā)相關(guān)牙周病疫苗一直為該領(lǐng)域研究熱點。有研究用基因疫苗pCTLA4-fimA免疫小鼠，觀察到血清中特異性抗體IgG，唾液中特異性抗體IgA增強(qiáng)，小鼠牙槽骨水平與免疫前相比吸收程度降低[6-7]。GIBSON等[8]也認(rèn)為rgpA基因疫苗較rgpB能更有效地抑制牙槽骨吸收。研究發(fā)現(xiàn)在牙周炎患者的血清和齦溝液中存在P.g的特異性抗體,特異性抗體與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[9]，表明宿主的防御機(jī)制發(fā)生了激活，雖然其產(chǎn)生抗體不能完全消除P.g的感染，但這也提示可以通過開發(fā)針對P.g的基因疫苗去預(yù)防P.g誘導(dǎo)的牙周炎。

黏膜免疫作為人體的第一道防線，可以提供高效的保護(hù)作用。然而，大多數(shù)商業(yè)疫苗全身輸送，只誘導(dǎo)體液免疫保護(hù)，而沒有病原體特異性黏膜免疫[10]。鼻黏膜滴注免疫方式可以成功誘導(dǎo)體液免疫及黏膜共同免疫，具有無需專業(yè)人員操作即可大面積接種,給藥方便安全，無痛苦，易接受等特點，對疫苗的推廣普及具有重大意義。而且,鼻黏膜的血管及淋巴組織豐富，不規(guī)則程度更高,與其他部位黏膜相比更具有滲透性[11]，更有利于抗原的攝取。本實驗所使用的牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA、pVAX1-HA2-FimA/IL-15是前期由課題組以FimA與HA2聯(lián)合，串聯(lián)細(xì)胞因子IL-15所構(gòu)建。通過對SD大鼠進(jìn)行免疫觀察發(fā)現(xiàn)，各實驗組特異性抗體水平均較對照組及免疫前水平高，在免疫第5周抗體水平達(dá)到高峰。這可能與以鼻黏膜免疫作為免疫途徑，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了體液免疫應(yīng)答及黏膜共同免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答的效應(yīng)有關(guān)。

黏膜免疫反應(yīng)和口腔中防御病體入侵的主要免疫球蛋白均為sIgA。sIgA主要來源于黏膜中的B1細(xì)胞，IL-15可以特異性地作用于被抗原致敏的B1細(xì)胞，誘導(dǎo)并促進(jìn)其增殖[12]。國內(nèi)有學(xué)者也證明IL-15對于基因疫苗產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是有正向調(diào)節(jié)作用的[13]。因此，本實驗以檢測唾液之中sIgA型特異性抗體的水平作為觀察指標(biāo)，并直接將IL-15基因串聯(lián)入重組質(zhì)粒中，避免了免疫操作復(fù)雜等問題。在疫苗免疫的過程中，由于免疫原性較弱，常常導(dǎo)致免疫耐受的發(fā)生，因而免疫佐劑便被應(yīng)用于激發(fā)較強(qiáng)的黏膜免疫應(yīng)答。目前黏膜免疫常用的佐劑包括腸毒素(CT)和霍亂毒素(LT),細(xì)胞因子也可作為佐劑增強(qiáng) DNA 疫苗的黏膜免疫效果。本實驗中選用IL-15作為免疫佐劑來增強(qiáng)免疫效應(yīng)，在實驗中疫苗免疫組pVAX1-HA2-FimA/IL-15相比免疫組pVAX1-HA2-FimA抗HA2、FimA特異性抗體水平更高，且使用IL-15佐劑免疫組抗體下降程度稍緩，這說明IL-15佐劑的使用可能有助于維持抗體高水平的持續(xù)時間，可以作為牙齦卟啉單胞菌疫苗的佐劑有效增強(qiáng)抗體的免疫水平。免疫后局部鼻黏膜組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測目的蛋白，顯示在鼻黏膜骨骼肌、巨噬細(xì)胞、腺體和腺管內(nèi)可見FimA的表達(dá)，由于其該蛋白為分泌型蛋白，可見其呈現(xiàn)彌散狀分布于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中。

本研究表明，以HA2、FimA基因聯(lián)合的牙周炎基因疫苗能夠成功誘導(dǎo)實驗大鼠共同黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對于牙周炎的預(yù)防有潛在價值。