陳 晨，金 旭，翁稚穎，朱煥利，鄭昌博，劉偉軍，代澤蘭，肖 創(chuàng)，楊之斌△，楊為民▲

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨云南省腫瘤醫(yī)院，昆明 650118)

發(fā)生在結(jié)腸和直腸的結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大常見惡性腫瘤[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，到2030年，CRC的預(yù)期發(fā)病者超過220萬新病例和110萬死亡[2]。在我國(guó)，CRC的發(fā)病率和病死率每年均保持上升趨勢(shì)，由高到低依次為東部地區(qū)、中部地區(qū)、西部地區(qū)，且男性高于女性，年長(zhǎng)者高于年輕者[3-4]。CRC的一般治療手段包括手術(shù)切除、放射治療和化療[5]。另外，使用抗血管生成療法(如貝伐單抗)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)抑制劑(如西妥昔單抗)的靶向治療也只在特定患者中有一定治療作用[6-7]，但患者的生存率仍然不高，5年內(nèi)約為60%[8]，因此，需要尋找新的治療方案。

cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase,PKG)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PKG有兩種亞型，即PKG-Ⅰ和PKG-Ⅱ。近年來的一些研究表明，PKG具有舒張血管，改善血管功能等作用[9-10]，但在抗腫瘤特別是抗結(jié)腸癌方面鮮為少見。cAMP依賴性蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase,PKA)與PKG同樣是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，目前對(duì)PKA的研究大多集中在大腦學(xué)習(xí)記憶方面，包括神經(jīng)退行性疾病阿爾茲海默癥和帕金森病等[11-12]，但關(guān)于結(jié)腸癌方面的報(bào)道卻較少。血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀和極性的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，是PKG與PKA的共同作用底物蛋白。PKG優(yōu)先磷酸化Ser239(p-VASP Ser239)處的VASP，而PKA則是優(yōu)先磷酸化Ser157(p-VASP Ser157)處的VASP。有報(bào)道指出，VASP蛋白的表達(dá)與癌癥患者的疾病進(jìn)展呈正相關(guān)，并且強(qiáng)調(diào)了它在惡性腫瘤中的重要性[13]。因此作者推測(cè)，作為VASP的直接上游蛋白激酶，PKG與PKA的表達(dá)與活性的變化與CRC有關(guān)。

基于以上文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過檢測(cè)分析CRC組織中PKG、PKA、VASP及其磷酸化蛋白的表達(dá)情況，旨在為CRC患者尋找到新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年3-9月云南省腫瘤醫(yī)院結(jié)腸外科經(jīng)手術(shù)切除的20例患者的癌變組織及其癌旁正常組織。20例患者相關(guān)的臨床病例指標(biāo)包括性別、年齡、腫瘤直徑大小、腫瘤分化程度、TNM分期以及腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)及糖蛋白125(CA-125)的測(cè)定結(jié)果。所有組織標(biāo)本在手術(shù)完成后30 min獲得，再放于液氮中保存。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 PKG-Ⅰ兔單抗 (貨號(hào)：#3248) 、PKG-Ⅱ兔單抗 (貨號(hào)：#3248)、PKA兔單抗 (貨號(hào)：3927S)以及GAPDH兔單抗(貨號(hào)：#2118)均購自美國(guó)Cellsignaling technology公司；VASP兔多抗(貨號(hào)：SC-1395)、p-VASP Ser239兔多抗(貨號(hào)：SC-23507)、p-VASP Ser157鼠單抗(貨號(hào)：SC-365563)、羊抗兔二抗(貨號(hào)：SC-2005)和羊抗鼠二抗(貨號(hào)：SC-2004)均購自美國(guó)Santa cruz 公司；二辛酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：P0012)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Western blot檢測(cè)所用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳儀和半干轉(zhuǎn)儀購自美國(guó)BIO-RAO公司。

1.2.2Western blot 分析 將標(biāo)本從液氮中取出后，快速剪成小塊后在冰上進(jìn)行勻漿。收集勻漿經(jīng)4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清液。以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。上樣20 μg 蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，后予15 V，30 min半干轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下，用5%脫脂奶粉TBST緩沖液對(duì)膜進(jìn)行封閉1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。PKG-Ⅰ、PKG-Ⅱ、PKA、VASP、 p-VASP Ser157和p-VASP Ser239各個(gè)抗體(1∶500～1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。如前所述洗膜后，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗IgG抗體(1∶8 000～1∶10 000)室溫孵育1 h。洗膜，化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯跡。同時(shí)用GAPDH抗體(1∶10 000)作為內(nèi)參照。采用Scion Image圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot圖像進(jìn)行分析計(jì)算。每例標(biāo)本每個(gè)蛋白重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 PKG-Ⅰ、PKG-Ⅱ、PKA、VASP、 p-VASP Ser157和p-VASP Ser239各蛋白經(jīng)Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在每例CRC標(biāo)本中均有表達(dá)。這些蛋白的表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期及CEA和CA-125有一定的相關(guān)性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2Western bolt檢測(cè)結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，CRC組織中的PKG-Ⅰ、PKG-Ⅱ、VASP、p-VASP Ser157和p-VASP Ser239蛋白表達(dá)水平均顯著低于癌旁正常組織(P<0.05)。然而，CRC組織中的PKA蛋白表達(dá)水平與癌旁正常組織相比并無明顯差異，見圖1。

表1 CRC組織中各蛋白因子與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性(n=20)

1：癌旁正常組織；2：結(jié)直腸癌組織；a：P<0.05,b：P<0.01，與癌旁正常組織比較

圖1Westernblot檢測(cè)CRC組織與癌旁正常組織中PKG、PKA、VASP及其磷酸化蛋白表達(dá)

3 討 論

PKG是蛋白激酶AGC家族的成員，從兩個(gè)不同的基因轉(zhuǎn)錄為兩種亞型，即PKG-Ⅰ和PKG-Ⅱ。PKG-Ⅰ分布比較廣泛，在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)、神經(jīng)元、血小板、血管和腸平滑肌細(xì)胞分布較多，在心肌、血管內(nèi)皮和大多數(shù)白細(xì)胞中表達(dá)較少。PKG-Ⅱ表達(dá)更多的分布于腦、腸和腎。在腸道中，PKG-Ⅱ參與囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)劑陰離子通道和氯通道的活化，引起氯化物和碳酸氫鹽的外排，然后使水流入腸腔，從而調(diào)節(jié)腸壁細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓[14]。PKA是A型激酶錨定蛋白家族成員，由催化亞基和抑制性調(diào)節(jié)亞基組成，其通過磷酸化底物蛋白或轉(zhuǎn)錄因子，以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。PKA參與多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝及增殖等過程[15]。VASP屬于接頭蛋白 Ena/VASP 家族，可將細(xì)胞骨架系統(tǒng)連接到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且它在細(xì)胞骨架組裝、成纖維細(xì)胞遷移、血小板活化和軸突導(dǎo)向中發(fā)揮重要作用[16]。VASP作為PKG與PKA的共同作用底物，其區(qū)別在于兩種激酶對(duì)其作用的磷酸化位點(diǎn)不同，分別為p-VASP Ser239與p-VASP Ser157，兩種磷酸化蛋白的表達(dá)水平分別可提示PKG與PKA的活化水平。在本研究中，作者通過檢測(cè)20例CRC患者病變癌組織與正常癌旁組織中的PKG-Ⅰ與PKG-Ⅱ的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CRC組織中的兩種蛋白顯著低于正常的癌旁組織；同時(shí)，CRC組織中反映PKG活性的p-VASP Ser239的表達(dá)水平也顯著降低。這一研究結(jié)果提示，PKG蛋白的表達(dá)及活性均與CRC密切相關(guān)。雖然CRC組織中PKA的表達(dá)水平與正常組織中的表達(dá)相比并沒有明顯差異，但反映PKA活性的p-VASP Ser157的表達(dá)明顯降低，這一結(jié)果提示，CRC雖對(duì)PKA蛋白表達(dá)無顯著影響，但對(duì)其活性卻有顯著影響。另外，CRC中的VASP的表達(dá)水平同樣明顯降低。

WALDKIRCH等[17]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKG-Ⅰ在腫瘤組織高表達(dá)時(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，因此推測(cè)其可能具有一定的抗腫瘤作用。與正常細(xì)胞相比，許多腫瘤類型的PKG-Ⅰ表達(dá)降低，其中也包括從結(jié)腸切除標(biāo)本中收集的腫瘤組織。有研究表明，PKGⅠ對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的生長(zhǎng)抑制是由于減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子導(dǎo)致血管生成嚴(yán)重缺乏。有研究人員提出其機(jī)制可能是PKG-Ⅰ參與的凋亡通路MEKK1/MEK4/ JNK通路有關(guān)[18]。雖然目前還少有PKG-Ⅱ?qū)Y(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展作用方面的報(bào)道，但已經(jīng)有關(guān)于其他癌癥方面的報(bào)道。FALLAHIAN等[19]的研究結(jié)果顯示cGMP可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，并提出這一作用時(shí)與PKG-Ⅱ有關(guān)。近年來，有研究顯示PKG-Ⅱ在胃癌組織中表達(dá)和活性均明顯降低，并且證實(shí)提高PKG-Ⅱ活性可明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而這一作用可能與EGFR/MAPK/ERK通路和EGFR/MAPK/JNK通路相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PKG-Ⅰ與PKG-Ⅱ在CRC中的表達(dá)水平低于正常組織，并且反映其活性的磷酸化底物p-VASP Ser239的蛋白同樣在CRC組織中表達(dá)減少，表明PKG兩種亞型的表達(dá)及活性均被抑制，這一結(jié)果與上述WALDKIRCH等[17]的結(jié)果一致。

錢晶等[20]在研究CRC肝轉(zhuǎn)移中cAMP/PKA通路的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，給小鼠腹腔注射cAMP類似物8-溴-cAMP后，原發(fā)灶中的PKA有微弱減少，而VEGF、E-鈣粘蛋白及MMP2 的表達(dá)卻有顯著變化。TINSLEY等[21]研究表明增加cAMP以激活結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中的PKA并不顯著促成細(xì)胞死亡。然而，LEIPHRAKPAM等[22]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在FET和GEO結(jié)腸癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)增加細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與PKA的激活有關(guān)。

PKG與PKA是分別依賴于細(xì)胞內(nèi)cGMP與cAMP水平磷酸化特定蛋白的激酶，與其相關(guān)的經(jīng)典的信號(hào)通路分別為NO-cGMP-PKG與AC-cAMP-PKA。BABYKUTTY等[23]的研究顯示NO-cGMP-PKG通過激活ERK-1/2和AP-1促進(jìn)MMP-2/9的表達(dá)，可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移/侵襲。FRANCIS等[24]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的磷酸二酯酶(PDE)的可同時(shí)降低胞內(nèi)cGMP與cAMP水平，抑制PKG與PKA活性，并表明非甾體類抗炎藥可通過抑制PDE的活性可增加cGMP與cAMP水平從而激活PKG與PKA，但通過抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞凋亡僅與PKG有關(guān)[25]。

VASP作為一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，也是細(xì)胞骨架蛋白，它控制著癌細(xì)胞的形狀、極性和細(xì)胞分裂，遷移和侵襲的膜組織。有研究表明，VASP Ser磷酸化作為調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合速率和細(xì)胞骨架依賴性細(xì)胞器的關(guān)鍵因子，調(diào)控著絲狀偽足、板狀偽足、侵襲偽足、粘著斑和細(xì)胞-細(xì)胞連接等肌動(dòng)蛋白依賴的膜細(xì)胞器[26]。宋勝江等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，VASP在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織，這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致。ALI等[28]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別抑制p-VASP Ser157和誘導(dǎo)p-VASP Ser239 VASP磷酸化可控制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組裝以及結(jié)腸癌細(xì)胞的存活和死亡行為，這一結(jié)果表明，VASP Ser磷酸化的失調(diào)可能是造成結(jié)腸癌永生和侵襲性細(xì)胞表型發(fā)育的潛在因素。在本研究中反映PKA活性的p-VASP Ser157在CRC組織中與p-VASP Ser239同時(shí)降低，與ALI等[28]研究相悖，推測(cè)可能與研究對(duì)象不同有關(guān)：ALI等[28]研究用的結(jié)腸癌細(xì)胞，細(xì)胞種類較為單一，而本研究中用的是結(jié)腸癌組織，可能其中也含有其他細(xì)胞種類；另外，由于臨床標(biāo)本珍貴、難得，推測(cè)可能與本研究的樣本量偏少有關(guān)，在后續(xù)相關(guān)研究中，將考慮增大樣本量。

本文系統(tǒng)的研究了PKG兩種亞型、PKA、VASP以及反映PKG與PKA活性的兩種VASP Ser磷酸化蛋白的表達(dá)水平在CRC組織已經(jīng)正常癌旁組織中的表達(dá)，研究結(jié)果提示PKG兩種亞型的活性及表達(dá)與CRC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這一結(jié)果與目前的相關(guān)報(bào)道呈現(xiàn)一致性。目前，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究揭示藥物開發(fā)的新治療靶點(diǎn)，這種前景正在改善；而本研究結(jié)果正是為臨床診斷治療CRC尋找到新的治療靶點(diǎn)提供了參考依據(jù)。