武鑫玲，姜 娟

(1.鄭州人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，鄭州 450053；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，北京 100044)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心內(nèi)科常見(jiàn)疾病之一，預(yù)后較差，具有較高的病死率，給人們的健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。AMI是由于心臟的供血血管發(fā)生急性閉塞，影響相應(yīng)的心肌組織的血供而導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)缺血、缺氧，甚至發(fā)生壞死[1]。傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，AMI時(shí)心肌組織的損傷為不可逆。而最近研究表明，哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞在A(yíng)MI時(shí)仍未退出細(xì)胞周期，因此仍具有再生能力[2-3]。患者的心臟功能在A(yíng)MI發(fā)生早期受到調(diào)節(jié)會(huì)發(fā)生心肌重構(gòu)。他汀類(lèi)藥物是目前臨床降脂、降壓的常用藥物。研究顯示，他汀類(lèi)藥物有助于改善心肌重構(gòu)。瑞舒伐他汀是一種他汀類(lèi)藥物，具有穩(wěn)定冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、抗炎、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[4-5]。本研究通過(guò)AMI大白兔模型的建立，觀(guān)察他汀類(lèi)藥物對(duì)兔AMI后心肌重構(gòu)的作用，并探索其中的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑 HPSonos 5500超聲診斷系統(tǒng)(美國(guó)HP公司)，美國(guó)ABI9700RT-PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo公司)；瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)H20110563)，基質(zhì)金屬蛋白(MMP)-2、-9、-10，骨膜蛋白(Perionstin蛋白)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1兔多克隆抗體(美國(guó)BD公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大白兔，雄性，18個(gè)月齡，體質(zhì)量(2.41±0.11)kg，合格證號(hào)[SCXK(蘇)2007-0008]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫，濕度45%～70%，自由進(jìn)食飲水。

1.2方法

1.2.1造模與給藥方法 首先麻醉兔，于腹腔注射20%烏拉坦(0.4 mL/kg)，固定兔子仰臥于手術(shù)臺(tái)上，將頸部及胸部被毛剪除，將頸部皮膚縱形剪開(kāi)1.5～2.0 cm，對(duì)于皮下組織及肌肉進(jìn)行分離，使氣管及其上甲狀腺腺體顯露；鈍性分離氣管并帶線(xiàn)，將絲線(xiàn)提起，于氣管環(huán)之間將氣管剪開(kāi)半周，行氣管插管；對(duì)呼吸參數(shù)，包括呼吸頻率、吸呼比及潮氣量進(jìn)行調(diào)整；胸骨左緣3 mm將胸部皮膚縱形剪開(kāi)約4 cm，對(duì)皮下、胸大肌與前鋸肌進(jìn)行鈍性分離，對(duì)胸大肌及前鋸肌進(jìn)行縫合、牽開(kāi)，使肋骨及肋間肌顯露，將肋間肌于第3肋間逐步剪開(kāi)，使胸膜顯露，于呼氣時(shí)刺破胸膜進(jìn)入胸腔；撐開(kāi)肋骨，顯露心臟；探查確定左心耳，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近端，13 mm針Prolene線(xiàn)縫扎，出針，打結(jié)，探查無(wú)出血后關(guān)胸，將一根吸引管留置于胸腔內(nèi)，縫合肋間對(duì)術(shù)野進(jìn)行消毒；對(duì)合胸大肌與前鋸肌并縫合，將胸腔積氣積液用針筒抽吸，將吸引管拔出；兔子蘇醒后，拔管，對(duì)氣道血塊及分泌物進(jìn)行清理，氣管切口以Prolene線(xiàn)一針縫合，碘伏消毒術(shù)野，對(duì)合肌肉及皮下，縫合頸部切口。手術(shù)后24 h內(nèi)11只大白兔死亡。將存活的69只兔子分為3組：心肌梗死對(duì)照組(MI組，n=20)、瑞伐他汀組(R組，n=22)、假手術(shù)組(S組，n=27)。S組并不在冠狀動(dòng)脈處結(jié)扎僅穿線(xiàn)；R組兔子灌胃給予10 mg·kg-1·d-1瑞舒伐他汀鈣，每日1次，灌胃處理4周；MI組建立AMI后不予任何操作。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢查 干預(yù)結(jié)束使用HP Sonos 5500超聲診斷系統(tǒng)(頻率12 MHz)對(duì)3組大白兔進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。檢測(cè)指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心房直徑(LAD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左心室短軸縮短率(LVFS)等。

1.2.3左心室梗死面積計(jì)算 將左心室切片置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中染色30 min，蒸餾水沖洗后，心肌梗死區(qū)未著色顯示灰白色，非梗死區(qū)經(jīng)過(guò)染色后顯示深紅色。采用ImagePro Plus軟件(version 6.0)計(jì)算梗死面積和左心室總面積，以梗死面積/左心室總面積表示梗死面積的大小。

1.2.4檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 常規(guī)TUNEL法，由福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供試劑盒，檢測(cè)心肌組織中的凋亡細(xì)胞。光鏡觀(guān)察細(xì)胞核棕色為陽(yáng)性，凋亡指數(shù) (AI) =視野凋亡數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5檢測(cè)心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3的表達(dá) 將心肌組織用機(jī)械法剪碎，過(guò)濾并制成單細(xì)胞懸液，將5 mL單細(xì)胞懸液加入試管中，常規(guī)離心后去上清液，加入100 μL固定液后混勻，靜置15 min。加4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，常規(guī)離心，去上清液，加入100 μL裂解液，室溫靜置入5 min。加5 μL美國(guó)Santa Cruz Biotechnology的Caspase-3抗體，混勻，避光靜置15 min。加4 mL PBS，離心，去上清液，加PBS 0.5～1.0 mL。使用日本BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

表1 3組大白兔超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較

a：P<0.05，與S組相比；b：P<0.05，與MI組相比

1.2.6檢測(cè)p-p38蛋白和p38 常規(guī)方法提取樣品蛋白，標(biāo)化后聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后，以5%的脫脂牛奶1∶200稀釋兔單抗p-p38抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnologyy)、兔單抗p38抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology)，1∶1 000稀釋兔多抗actin抗體(武漢博士德公司)；置搖床4 ℃孵育過(guò)夜;將辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的鼠、兔二抗用5%脫脂牛奶1∶200稀釋?zhuān)負(fù)u床上孵育聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，之后于凝膠成像系統(tǒng)曝光。

2 結(jié) 果

2.13組大白兔超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較 3組間超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與S組相比，MI組與R組的LAD、LVDd和LVDs均顯著增加，同時(shí)LVEF和LVFS降低(P<0.05)；R組LAD、LVDd和LVDs與MI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.23組大白兔心肌梗死面積比較 S組心肌梗死面積為0，MI組(37.92±4.29)%與R組(36.71±3.98)%間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3瑞伐他汀對(duì)兔子心肌梗死邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡的影響 MI組[(24.42±2.52)%]和R組[(9.31±0.31)%]凋亡指數(shù) (AI)顯著高于S組[(2.65±0.32)%](P<0.05)，R組AI較MI組顯著降低(P<0.05)。

2.4不同組心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3的表達(dá)情況 R組及MI組心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3表達(dá)較S組明顯升高，而R組較MI組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.5不同組心肌梗死邊緣區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)情況 MI組、R組、S組p38表達(dá)均未見(jiàn)明顯差異，MI組和R組p-p38表達(dá)較S組顯著升高，而R組較MI組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a：P<0.05，MI組與S組比較；b：P<0.05，R組與MI組比較；c：P<0.05，R組與S組比較

圖1各組心肌梗死邊緣區(qū)Caspase-3的表達(dá)

A：Western blot法檢測(cè)兔心肌梗死邊緣區(qū)p38、p-p38的表達(dá)；B：半定量分析；a：P<0.05，S組與MI組比較；b：P<0.05，R組與MI組比較；c：P<0.05， R組與S組比較

圖2各組兔心肌梗死邊緣區(qū)p38、p-p38的表達(dá)

3 討 論

AMI后心肌細(xì)胞受損，導(dǎo)致心室肥厚、擴(kuò)張，心肌收縮力下降，心肌纖維化增加，最終導(dǎo)致心力衰竭，給患者帶來(lái)嚴(yán)重后果[6-7]。本研究中建立AMI大白兔模型，以探究AMI的發(fā)病機(jī)制，以及可能存在的病理變化。

本研究在對(duì)兔子模型進(jìn)行不同干預(yù)4周后行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，結(jié)果顯示，與S組相比，MI組與R組的LAD、LVDd和LVDs均顯著增加，同時(shí)LVEF和LVFS降低(P<0.05)，說(shuō)明大白兔在心肌梗死后出現(xiàn)心臟擴(kuò)大、左心室收縮功能不全。另外，R組LAD、LVDd和LVDs與MI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI組(P<0.05)，提示瑞舒伐他汀能増強(qiáng)心肌梗死大白兔的左心功能。但MI組與R組間的心肌梗死面積比較并未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)，提示瑞舒伐他汀并不能達(dá)到顯著地減少心肌梗死面積的目的。

心室重構(gòu)是心肌細(xì)胞凋亡所引起，有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死大鼠除梗死區(qū)外，梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)亦可檢出細(xì)胞死亡，而這是引起左心室重塑和晚期心功能不全的重要因素[8-9]。本研究結(jié)果顯示，R組心肌細(xì)胞AI較MI組顯著降低(P<0.05)，提示瑞伐他汀治療能減少心肌細(xì)胞凋亡，可能通過(guò)抑制心肌凋亡，而使心功能改善。

目前認(rèn)為他汀類(lèi)藥物可能通過(guò)抑制心肌凋亡而使心功能改善，分析其抑制心肌細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制[10-12]：(1)通過(guò)抗氧化作用抑制心肌凋亡；(2)通過(guò)調(diào)控絲氨酸-蘇氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶，下調(diào)Caspase-3 活性。Caspase-3在細(xì)胞的凋亡中起關(guān)鍵作用，是凋亡途徑中的執(zhí)行者。p38屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中的一個(gè)主要成員，研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死后，p38并未增高，但p-p38在心肌梗死后7 d時(shí)升高2倍以上，p-p38能激活凋亡程序中最后的執(zhí)行者Caspase-3的活性，使凋亡通路啟動(dòng)，活化的Caspase-3又能導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-15]。本研究中，R組p-p38、Caspase-3的表達(dá)低于MI組，推測(cè)瑞舒伐他汀可能通過(guò)抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能。結(jié)果表明瑞舒伐他汀能抑制心肌凋亡、改善心功能，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)已梗死的心肌組織，提示已壞死的心肌組織無(wú)法通過(guò)藥物恢復(fù)正常功能。因此，早期對(duì)AMI患者使用保護(hù)心肌細(xì)胞藥，避免梗死進(jìn)一步加重是改善患者預(yù)后、提高生存率的重點(diǎn)。

綜上所述，瑞舒伐他汀可以使AMI大白兔的心臟功能顯著改善，可能通過(guò)抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重構(gòu)。