余露山，曾 蘇

0 引 言

腫瘤是最常見的惡性疾病之一，其發(fā)病率、致死率名列前茅，嚴重威脅人們的生命健康［1］。一些化學治療藥物，效率不高，重復性差，毒性較大，特別是腫瘤對于化療藥物的多藥耐藥性成為腫瘤治療的難點。腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎腺癌（簡稱腎癌），占腎惡性腫瘤的90%，占人類惡性腫瘤的2%～3%；70%～85%腎癌為透明性腎細胞癌（clear cell RCC，ccRCC）［2］。目前，在局限于腎及其局部淋巴結(jié)的RCC患者中，腎切除術或保留腎單位的腫瘤切除術是主要的治療方式，而對于轉(zhuǎn)移性RCC，細胞毒抗癌藥物如鉑類等治療在RCC中幾乎沒無益處，即RCC具有高度耐藥性，然而其機制尚未明確［3］。因此，研究腫瘤耐藥新機制，有助于發(fā)現(xiàn)藥物作用新靶標和新療法。

1 藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體與腫瘤耐藥

藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體參與了抗腫瘤藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）過程，對抗腫瘤藥物療效發(fā)揮起了重要的作用。目前，對腫瘤耐藥的研究多集中在腫瘤藥物作用靶點和腫瘤微環(huán)境，對腫瘤耐藥與藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體的關系研究較少；對藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體介導的抗腫瘤藥物ADME的過程研究較多，而對藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體與腫瘤防治的關系研究較少。藥物代謝酶可以使抗腫瘤藥物激活或失活，藥物轉(zhuǎn)運體可以將抗腫瘤藥物攝取進入或外排出腫瘤細胞，因此，藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用［4］。其中，藥物轉(zhuǎn)運體變異使抗癌藥物攝取減少或外排增加可引起耐藥，因此，藥物轉(zhuǎn)運體是腫瘤耐藥的潛在靶點和生物標志物［5］。表1列舉了基于藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生耐藥性的部分抗腫瘤藥物，包括靶向藥物和細胞毒藥物。

表1 基于藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生耐藥性的部分抗腫瘤藥物Table 1 Some anti-tumor drugs producing drug resistance based on drug metabolizing enzymes and transporters

SLC22A2基因編碼的有機陽離子轉(zhuǎn)運體OCT2（organic cation transporter member 2），定位于人類基因組chr 6q26上，共編碼555個氨基酸，其二級結(jié)構具有12個跨膜區(qū)域［6］。SLC22A2基因近端啟動子區(qū)含有兩個CpG島（CpG islands，CGI），分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游和-320～-66bp和下游+76～+644bp。另外，遠端啟動子區(qū)也含有一個CGI，位于TSS上游-1605～-1402bp。SLC22A2主要分布在腎近曲小管的基底側(cè)［7］，是腎中最主要的有機陽離子轉(zhuǎn)運體［8］，在腎小管的藥物分泌和重吸收過程中發(fā)揮重要作用，因此，其功能涉及臨床上很多內(nèi)源性物質(zhì)和常用藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程，其底物包括奧沙利鉑（oxaliplatin，Oxa）等鉑類抗腫瘤藥物［9］。

鉑類藥物主要經(jīng)OCTs攝取進入細胞發(fā)揮細胞毒性作用，同時也經(jīng)腎小管上皮細胞基底膜上的OCTs和頂膜上的多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運蛋白MATE-2K分泌至尿液，排出體外。Burger等［10］發(fā)現(xiàn)，OCT2對各鉑類化合物的轉(zhuǎn)運能力不同，由高到低依次為奧沙利鉑、二氯環(huán)己二氨合鉑、奧馬鉑、反鉑、順鉑，而對卡鉑則沒有轉(zhuǎn)運能力。還有研究證明OCT2能顯著增加奧沙利鉑在細胞內(nèi)的積聚，增強細胞毒性［11-12］。雖然鉑類藥物也可經(jīng)其他有機陽離子轉(zhuǎn)運體如OCT1［11］、OCT3［13］攝取進入細胞，但這些轉(zhuǎn)運體在腎小管上皮細胞中的表達較低，親和力也較弱，因此OCT2的表達水平與活性對鉑類抗癌藥尤其是奧沙利鉑在腎癌細胞中的積聚以及細胞毒性起決定作用。

2 藥物表觀遺傳學與耐藥

藥物基因組學研究的是基因序列多態(tài)性（突變）引起的藥物療效和毒性的變化，雖然藥物基因組學是臨床個體化用藥的重要因素，然而只能解釋一部分臨床藥物治療的個體差異性［14］。藥物表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達可遺傳的變化引起藥物代謝、響應和毒性改變的機制及其應用。有研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學也通過影響編碼藥物ADME蛋白的基因表達，在臨床個體化用藥方面發(fā)揮重要作用［14-17］。表觀遺傳學為DNA序列未改變的情況下而引起的基因表達的可遺傳性改變［18］。表觀遺傳機制包括DNA甲基化、染色質(zhì)變異：組蛋白共價和非共價修飾機制、非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。DNA甲基化是由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）介導的化學修飾，主要發(fā)生在CGI，通常與基因的轉(zhuǎn)錄抑制相關，且DNA甲基化是可逆的，癌癥中DNA甲基化的異常已成為研究熱點。核小體是由DNA和組蛋白形成的染色質(zhì)基本結(jié)構單位，包含4個亞基H1-H4，組蛋白翻譯后的修飾如組蛋白乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化、糖基化等能調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄機制，其中乙?；图谆茄芯繜狳c。組蛋白甲基化指發(fā)生在H3和H4組蛋白N端精氨酸或者賴氨酸殘基上的甲基化，并不影響組蛋白電荷，其轉(zhuǎn)錄效應取決于受影響的殘基以及甲基化程度（單、雙、三甲基化）。組蛋白乙?；梢灾泻唾嚢彼釟埢恼姾梢詼p弱組蛋白與負電荷的DNA之間的相互作用，使得染色質(zhì)構象更為松散，通常組蛋白高乙?；龠M基因轉(zhuǎn)錄。與DNA甲基化類似，組蛋白乙酰化也是可逆的甚至更加活躍，在體內(nèi)處于高度動態(tài)的狀態(tài)，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；妇S持相對平衡。ncRNA是指不編碼蛋白質(zhì)，但具有某些功能的RNA。ncRNA包括miRNA、siRNA，及片段大于200bp的lncRNA、circRNA等，其中研究最為廣泛和成熟的是miRNA。目前，miR-122、miR-34等miRNA類藥物，已批準進入臨床試驗［19］?？梢姡幬锉碛^基因組的改變與傳統(tǒng)的基因突變的區(qū)別在于：表觀遺傳改變是可逆的，常發(fā)生在基因的啟動子區(qū)；而基因突變則一般是不可逆的，多發(fā)生在編碼區(qū)；表觀遺傳改變的回復頻率高于基因突變的回復頻率。進入21世紀以來，表觀遺傳修飾異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系頗受關注，很多異常修飾出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生明顯惡化之前，可以作為潛在的癌癥早期診斷和腫瘤分型的生物標志物以及預測治療效果和預后的標志物［20］。特別是表觀遺傳的可逆性，還可以作為藥物靶標，研發(fā)抗腫瘤藥物和新的聯(lián)合治療方案［21-23］，如圖1所示。

圖1 表觀遺傳學機制與藥物靶標和個體化治療的相關性Figure 1 Correlation between epigenetic mechanisms and drug targets and individualized treatment

3 腎癌耐藥的潛在靶標OCT2

Oncomine?數(shù)據(jù)庫中Microarray數(shù)據(jù)顯示，SLC22A2基因在腎癌腫瘤組織中的mRNA表達顯著低于癌旁組織。我們檢測了46對中國患者配對RCC組織，SLC22A2基因的mRNA和蛋白表達在腎癌患者腫瘤組織中顯著低于癌旁組織［24-25］。由于OCT2是鉑類藥物攝取進入腫瘤細胞的主要轉(zhuǎn)運體，提示OCT2低表達與RCC多藥耐藥可能有關。SLC22A2基因在腎癌組織中的表觀遺傳現(xiàn)象僅有少數(shù)報道，而機制研究更少［26-27］。我們進一步研究顯示，DNA甲基化導致RCC細胞系及患者中SLC22A2基因的轉(zhuǎn)錄抑制，其機制是SLC22A2基因近端啟動子區(qū)CpG島的高甲基化水平，尤其是近端啟動子區(qū)E-box位點的高甲基化，抑制了原癌基因c-MYC與E-box位點結(jié)合，c-MYC招募能力減弱引起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1募集降低，MLL1負責催化SLC22A2基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活信號H3K4Me3，高甲基化導致富集在SLC22A2基因啟動子區(qū)的組蛋白修飾H3K4Me3顯著下降，最終抑制起始轉(zhuǎn)錄，下調(diào)OCT2蛋白表達水平，見圖2。根據(jù)上述機制，我們在細胞水平和RCC細胞（786-O，Caki-1）裸鼠移植瘤模型，設計了DNMT抑制劑地西他濱（Decitabin，DAC）與OCT2底物類抗癌藥物Oxa的序貫聯(lián)合用藥方案，實驗發(fā)現(xiàn)表觀遺傳藥物DAC可以有效降低RCC細胞中SLC22A2基因的甲基化水平，增加OCT2的表達并提高Oxa在腫瘤組織及細胞的蓄積，聯(lián)合用藥策略能夠逆轉(zhuǎn)耐藥，殺死腫瘤細胞。

圖2 腎細胞癌中SLC22A2表達下降的DNA甲基化調(diào)節(jié)機制Figure 2 DNA methylation regulation mechanism of down-regulation of SLC22A2 expression in renal cell carcinoma

4 總結(jié)與展望

Winter等［28］采用MALDI-TOF MS測定ccRCC轉(zhuǎn)移（n=20）和原發(fā)瘤（n=34）患者樣本，結(jié)果顯示OCT2高表達，與腎癌細胞結(jié)果和我們的研究結(jié)果有差異；并發(fā)現(xiàn)腎其他轉(zhuǎn)運體OCT3、CTR1、SLC47A1也參與了奧沙利鉑的轉(zhuǎn)運，所以，作者認為需進一步研究OCT2在奧沙利鉑逆轉(zhuǎn)腎癌耐藥中作用。由于OCT2表達的個體差異，采用同一個腫瘤患者配對樣本研究才能獲得差異性表達的可比性結(jié)果，我們檢測了46對ccRCC患者腎癌及其配對癌旁組織中的OCT2，無論是mRNA和蛋白表達，腎癌組織均顯著低于其癌旁組織。OCT3和CTR1在腎組織中豐度較低且與奧沙利鉑的親和力也低［11，29］。DAC處理3株腎癌細胞后并不能增加MATE1的表達。奧沙利鉑也是MATE2K的底物，負責將藥物從腎外排至尿中；與配對的癌旁組織比較，MATE2K在腎癌組織中也是低表達，其機理涉及組蛋白修飾而與DNA甲基化無關［30］。DNA的甲基化在腎癌的診治中發(fā)揮了重要的作用［31］。DAC在打開腎癌細胞上OCT2前門的同時，保持關閉MATE2K這扇后門，使得通過前門進入的奧沙利鉑在腎癌細胞中蓄積，從而殺死腫瘤細胞。因此，鑒于OCT2在腎小管上皮細胞對鉑類抗腫瘤藥物尤其是奧沙利鉑的攝取中發(fā)揮主導作用，預測OCT2的表達丟失是RCC對奧沙利鉑耐藥的機制之一，我們研究發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化對腎細胞癌中OCT2表達下降的重要作用，闡明了其調(diào)節(jié)OCT2表達的機制，回答了“藥物攝取型轉(zhuǎn)運體動態(tài)修飾是腫瘤耐藥的干預靶點”這一重要科學問題。Sci Transl Med雜志高度認可了我們的研究成果，認為我們的研究“打開了藥物進入癌細胞的一扇門”［25］，Nat Rev Nephrol雜志也以“腎癌：OCT2去甲基化砸開了奧沙利鉑耐藥的門”為題高度評價了我們的研究工作［32］。然而，我們的工作僅在細胞異種移植瘤動物模型上獲得驗證，還需要開展以病人源性移植瘤模型和臨床試驗研究，以期獲得DAC和奧沙利鉑聯(lián)合應用給藥方案的臨床治療效果數(shù)據(jù)。