張正斌，朱麗雯，譚延振，馮攀，張冰，吳巖，易蔚，王曉明，孫陽*

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1老年病科，3心血管外科，西安 710032；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，咸陽 712000)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新和多向分化的潛能，廣泛用于組織損傷修復(fù)[1]。動物實(shí)驗(yàn)顯示MSCs對心肌梗死(myocardial infarction,MI)療效顯著，但是臨床實(shí)驗(yàn)表明自體干細(xì)胞移植治療MI療效不佳[2]。原因可能是動物實(shí)驗(yàn)中分離制備的是年輕供體來源的MSCs,而臨床實(shí)驗(yàn)中使用的干細(xì)胞多為MI患者自體采集的衰老MSCs。而衰老干細(xì)胞增殖、分化、分泌等生物學(xué)功能下降[3]，因此，如何延緩衰老是提高M(jìn)SCs修復(fù)能力的關(guān)鍵。C1q/TNF相關(guān)蛋白3(C1q/TNF-related protein 3,CTRP3)是新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，參與肝臟脂質(zhì)代謝、缺血心肌保護(hù)、細(xì)胞增殖分化等生理病理進(jìn)程[4,5]。Hou等[6]證實(shí)CTRP3通過激活磷酯酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)通路減輕缺血缺氧誘導(dǎo)的MSCs凋亡。本研究擬通過過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導(dǎo)構(gòu)建MSCs衰老模型，探討CTRP3對衰老MSCs抗損傷的作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 MSCs的培養(yǎng)

小鼠來源的P5代骨髓MSCs購于廣州賽業(yè)(MUBMX-01001)，細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清及1%雙抗(鏈霉素和青霉素)的間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(MUBMX-90011，廣州賽業(yè))中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 CTRP3蛋白的制備

CTRP3蛋白的制備方法同前[4]。CTRP3基因由GENEWIZ(江蘇，中國)產(chǎn)生，并克隆到原核蛋白表達(dá)載體pET30a(Novagen，Merck)中。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到BL21(DE3)細(xì)菌中。BL21(DE3)/pET30a-CTRP3在LB培養(yǎng)基中生長并在37℃下振蕩3 h。向培養(yǎng)基中加入異丙基-BD-硫代半乳糖苷(終濃度：1 mmol/L)。將溶液在16℃下振蕩4～5 h，并以5 000轉(zhuǎn)/min離心。通過HisTrap HP純化蛋白質(zhì)，除去內(nèi)毒素后將蛋白質(zhì)脫鹽濃縮。

1.3 MSCs衰老模型的建立

MSCs在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)加入不同濃度的H2O2處理2～4 h,然后進(jìn)行衰老指標(biāo)檢測(細(xì)胞活力和β-半乳糖苷酶染色)。

1.4 CCK8測細(xì)胞活性

用CCK8試劑盒(C008-3,七海生物)測定不同處理組細(xì)胞的增殖活性。將MSCs接種于96孔板，待細(xì)胞融合至70%，換無血清培養(yǎng)基，不同條件處理后，向每孔中加入10 μl CCK-8液，避光孵育2～4 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量吸光度值(A450 nm)。

1.5 細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色

250 μmol/L H2O2處理MSCs，2 h或4 h后，行β-半乳糖苷酶染色，試劑購于碧云天(C0602)。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS輕洗后加入固定液固定20 min。吸去固定液，加入染色液(配置:β-Gal染色液A,B,C分別10,930,10 μl;X-Gal 溶液50 μl)，37℃水浴過夜，避光。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，β-半乳糖苷酶染色陽性的細(xì)胞為衰老細(xì)胞，顯示藍(lán)色。

1.6 MSCs成脂成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

成骨、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒購于廣州賽業(yè)(MUBMX-90021，MUBMX-90031)。成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)時(shí)，P6代MSCs接種于預(yù)包埋0.1%明膠的6孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%，加入 2 ml成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。每3 d換液1次，3周后，待細(xì)胞形態(tài)明顯改變時(shí)，用茜素紅染色。1%鹽酸(Sigma-Aldrich)抽提茜素紅后420 nm酶標(biāo)儀讀數(shù)定量 (A420 nm)。成脂誘導(dǎo)時(shí)，將MSCs置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，加入MSCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液。誘導(dǎo)3 d后，吸走A液，加入培養(yǎng)基B液。24 h后吸走B液，換回A液。A液和B液交替作用5次后，繼續(xù)用B液維持培養(yǎng)7 d后用油紅O染色分析。PBS洗滌干燥后，200 μl的異丙醇抽提脂肪滴，酶標(biāo)儀510 nm波長測量吸光度值(A510 nm)。

1.7 Western blotting分析細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑按8∶1∶1混合配置細(xì)胞裂解緩沖液。裂解20 min后12 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心20 min，吸取上清液加入1/4體積上樣緩沖液后煮沸10 min。蛋白樣品在12%SDS-PAGE凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂牛奶孵育2 h。BAX(CST,2772),Bcl2(CST,3498),cleaved caspase 3(CST,9661)和GAPDH(CMCTAG,AT0002)一抗(1∶1 000)4℃過夜，TBST洗滌后，抗兔或抗鼠二抗(1∶5 000)(中杉金橋,ZB-2301,ZB-2305)室溫孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，Image lab軟件分析條帶灰度值，GAPDH作為內(nèi)參照。

1.8 RNA提取和RT-PCR

PBS輕洗細(xì)胞后，按每10 cm2加入1 ml TRIzol，用RNA提取試劑(Invitrogen)提取總RNA,具體操作同說明書。經(jīng)NanoDrop2000分光光度儀測定RNA濃度后用反轉(zhuǎn)錄試劑(TAKARA)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板擴(kuò)增P16，P21和SIRT1基因。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer suquence

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 H2O2呈濃度依賴性地抑制MSCs增殖活性

為探討氧化應(yīng)激對MSCs增殖活性的影響，分別用200、400、600 μmol/L H2O2處理MSCs 4 h和2 d后觀察細(xì)胞形態(tài)和增殖活性。光鏡下顯示對照組MSCs立體感強(qiáng)，形態(tài)均一，呈梭形，且生長密度大；而高濃度H2O2處理組(600 μmol/L)MSCs的形態(tài)皺縮變圓，密度明顯降低,細(xì)胞活力僅為對照組的40%(P<0.05)，且培養(yǎng)基中有較多漂浮細(xì)胞，表明600 μmol/L H2O2處理顯著增加細(xì)胞死亡(圖1)。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)H2O2處理呈濃度依賴性地抑制MSCs增殖活性，其中200 μmol/L H2O2抑制細(xì)胞增殖達(dá)約70%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖1)，可作為進(jìn)一步探討誘導(dǎo)MSCs衰老的最佳濃度。

2.2 成功建立衰老模型

200 μmol/L H2O2處理MSCs 2 h或4 h后，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性，β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞比例顯示細(xì)胞衰老。與對照組相比，200 μmol/L H2O2處理2 h組細(xì)胞密度變小，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)變大，β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞比例增加(P<0.05；圖2)。與200 μmol/L H2O2處理2 h組相比，200 μmol/L H2O2處理4 h，細(xì)胞活性顯著下降，衰老進(jìn)一步加重(P<0.05；圖2)。

2.3 CTRP3抑制MSCs的衰老

進(jìn)一步明確CTRP3蛋白是否會抑制MSCs衰老進(jìn)程。200 μmol/L H2O2處理4 h誘導(dǎo)MSCs衰老的同時(shí)，在培養(yǎng)基中加入CTRP3(終濃度為5 μg/ml)。4 h后撤去H2O2，繼續(xù)5 μg/ml CTRP3孵育MSCs 48 h。應(yīng)用β-半乳糖苷酶染色。與H2O2處理組相比，CTRP3明顯降低衰老細(xì)胞比例(P<0.05；圖3)。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組比較，200 μmol/L H2O2處理4 h后細(xì)胞增殖顯著受到抑制(P<0.05)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5 μg/ml的CTRP3可促進(jìn)衰老MSCs增殖，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05；圖3)。

2.4 CTRP3增強(qiáng)衰老MSCs的分化潛能

MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化，茜素紅染色，光鏡下觀察各組均有明顯的礦鹽沉積，H2O2處理組礦鹽沉積數(shù)量較對照組顯著減少。而與H2O2處理組相比，CTRP3處理顯著增加衰老MSCs的礦鹽沉積(圖4)。誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的MSCs經(jīng)1%鹽酸抽提后在420 nm波長讀數(shù)，結(jié)果顯示H2O2處理顯著降低MSCs的成骨分化能力(與對照組比較，P<0.05；圖4)。而CTRP3處理改善了衰老MSCs向成骨細(xì)胞分化的能力(與H2O2組比較，P<0.05)。MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化，油紅染色后光鏡下觀察到大量脂滴形成(圖4)。酶標(biāo)儀讀數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2組MSCs成脂能力較對照組顯著降低(P<0.05)，CTRP3處理可增強(qiáng)衰老MSCs向脂肪細(xì)胞分化的能力(與H2O2組比較，P<0.05；圖4)。

圖1 不同濃度H2O2處理對MSCs增殖活性的影響Figure 1 Effect of different doses of H2O2 on proliferation of MSCs (×100)MSCs:mesenchymal stem cells.Compared with CTRL group,*P<0.05;compared with 200 μmol/L H2O2 group,#P<0.05; compared with 400 μmol/L H2O2 group,△P<0.05.

圖2 H2O2處理誘導(dǎo)MSCs衰老模型的建立Figure 2 Establishment of MSCs aging model by H2O2 inductionA:×400;B:×100.MSCs:mesenchymal stem cells.Compared with CTRL group,*P<0.05;compared with 2 h group,#P<0.05.

圖3 CTRP3處理對MSCs的衰老及增殖活性的影響Figure 3 Effect of CTRP3 on aging and proliferation of MSCs (×400)CTRP3:C1q/TNF-related protein 3;MSCs:mesenchymal stem cells. Compared with CTRL group,*P<0.05;compared with H2O2 group, #P<0.05.

2.5 CTRP3抑制衰老MSCs凋亡

細(xì)胞凋亡影響MSCs生物學(xué)活性的發(fā)揮。接著，我們探討CTRP3是否對衰老引起的MSCs凋亡有抑制作用。TUNEL染色顯示，與對照組相比，H2O2組TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著增多(P<0.05)，CTRP3處理可顯著減少M(fèi)SCs凋亡(與H2O2組比較，P<0.05；圖5)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H2O2組cleaved caspase 3表達(dá)水平增高(P<0.05)，Bcl2/BAX表達(dá)水平降低(P<0.05)。而CTRP3降低衰老細(xì)胞cleaved caspase 3水平(P<0.05)，升高Bcl2/BAX (P<0.05;圖6)，證實(shí)衰老組MSCs凋亡較對照組加重，CTRP3能抑制衰老MSCs的凋亡。

圖4 CTRP3對衰老MSCs成骨成脂分化情況的影響Figure 4 Effect of CTRP3 on osteogenesis and adipogenesis of MSCs(×100)A:osteogenesis;B:adipogenesis.MSCs:mesenchymal stem cells;CTRP3:C1q/TNF-related protein 3.Compared with CTRL group,*P<0.05;compared with H2O2 group,#P<0.05.

圖5 CTRP3抑制衰老MSCs的凋亡Figure 5 Inhibition of CTRP3 on apoptosis of MSCsCTRP3:C1q/TNF-related protein 3;MSCs:mesenchymal stem cells.Compared with CTRL group,*P<0.05;compared with H2O2 group,#P<0.05.

圖6 CTRP3處理對衰老MSCs cleaved caspase 3, BAX和Bcl2等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of CTRP3 on expression of cleaved caspase 3,BAX and Bcl2 of MSCsCTRP3:C1q/TNF-related protein 3;MSCs:mesenchymal stem cells.Compared with CTRL group,*P<0.05;compared with H2O2 group,#P<0.05.

2.6 CTRP3下調(diào)P16和P21表達(dá)，上調(diào)SIRT1的表達(dá)

P16和P21通過上調(diào)衰老相關(guān)蛋白調(diào)控衰老進(jìn)程，而SIRT1抑制衰老。P16、P21和SIRT1通路已被證實(shí)參與H2O2誘導(dǎo)MSCs衰老進(jìn)程中[7]，為進(jìn)一步明確CTRP3對衰老MSCs的保護(hù)機(jī)制，我們通過RT-PCR檢測P16、P21通路和SIRT1表達(dá)激活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與衰老組相比，CTRP3處理組MSCsP16和P21mRNA水平顯著下降(P<0.05)，而SIRT1mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05；圖7)。表明CTRP3可能通過抑制P16和P21通路，激活SIRT1信號通路延緩MSCs衰老進(jìn)程。

圖7 CTRP3對MSCs衰老相關(guān)基因SIRT1,P16和P21 mRNA表達(dá)的影響Figure 7 Effect of CTRP3 on expression of SIRT1,P16 and P21 mRNA of MSCsMSCs:mesenchymal stem cells.Compared with CTRL group,*P<0.05;compared with H2O2 group,#P<0.05.

3 討 論

本研究通過建立氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰模型，研究CTRP3對衰老MSCs增殖、凋亡和分化等表型的影響。結(jié)果證實(shí)CTRP3能延緩MSCs衰老，P16、P21通路和SIRT1通路可能是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號通路。

近年來，MSCs移植對心肌梗死的療效一直受到爭議。缺血、炎癥、氧化應(yīng)激等病理?xiàng)l件常常誘導(dǎo)MSCs衰老凋亡，嚴(yán)重影響了MSCs的療效[7,8]。有研究證實(shí)移植MSCs在損傷部位僅僅存活數(shù)周到數(shù)月，細(xì)胞有限的存活期通常與不良的局部微環(huán)境誘導(dǎo)細(xì)胞早衰和凋亡有關(guān)[9]。體外H2O2誘導(dǎo)MSCs早衰模型常用于模仿體內(nèi)氧化應(yīng)激因素誘導(dǎo)移植MSCs衰老過程[10,11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2以濃度依賴的方式抑制MSCs增殖。高濃度H2O2直接引起細(xì)胞死亡，而低濃度H2O2處理的MSCs表現(xiàn)為細(xì)胞變大且扁平、細(xì)胞增殖能力下降及β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞比例增加，表明低濃度H2O2可成功誘導(dǎo)MSCs衰老模型的建立，這與先前的研究報(bào)道一致[11]。

CTRP3是CTRP家族中重要的成員，具有顯著的調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗炎和促血管生成等生物學(xué)作用[5]。最近的幾篇研究陸續(xù)報(bào)道CTRP3可通過抗氧化應(yīng)激途徑，減輕氧化應(yīng)激對心腦等重要靶器官的損害，體外實(shí)驗(yàn)表明CTRP3通過激活A(yù)MPK通路減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡[12,13]。另外，外源性給予CTRP3能激活PI3K/Akt通路，抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的MSCs凋亡[6]。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了CTRP3對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的MSCs衰老進(jìn)程的影響。通過β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTRP3顯著降低氧化應(yīng)激條件下衰老細(xì)胞的比例。進(jìn)一步檢測衰老細(xì)胞生物學(xué)功能和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)CTRP3促進(jìn)衰老MSCs增殖，增強(qiáng)衰老MSCs分化能力，抑制衰老MSCs凋亡，提示CTRP3可能是新的抗衰老和凋亡分子。P16可通過抑制CDK4/CDK6與cyclin D結(jié)合，P21則通過與多種cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，使細(xì)胞增殖停止于G1期，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老[14]。SIRT1信號通路的失活亦可促進(jìn)細(xì)胞衰老，損害細(xì)胞功能[11,15]。我們用RT-PCR的方法初篩了幾個(gè)衰老相關(guān)通路，發(fā)現(xiàn)CTRP3上調(diào)SIRT1mRNA表達(dá)水平，下調(diào)P16mRNA和P21mRNA表達(dá)水平。因此，我們推測，CTRP3發(fā)揮抗MSCs衰老的作用可能依賴于P16、P21和SIRT1通路。