常建蘭，于俊巖，王宇，郭紅亮，田向陽，劉平，李璐璐，周文雅

(長治醫(yī)學(xué)院：1附屬和平醫(yī)院腫瘤科，2附屬和濟(jì)醫(yī)院病理科，長治 046000)

結(jié)直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第4位，死亡率居世界第2位，中國結(jié)直腸癌患者的發(fā)病率和死亡率逐年增加，每年發(fā)病人數(shù)僅次于肺癌[1]。美國國立癌癥研究所流行病學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)庫顯示，結(jié)直腸癌患者中≥65歲人群的患病率最高。目前結(jié)直腸癌的診斷和治療手段有限，主要治療方法包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療、生物治療等，發(fā)現(xiàn)較早、身體狀態(tài)良好的老年患者可從手術(shù)、化療、放療等治療中獲益更多，而身體狀況較差的老年患者治療方案的選擇則受到一定的限制。靶向治療的毒性相對較低，適用于更廣泛的老年患者群體，因此，尋找有意義的靶點(diǎn)，可及早發(fā)現(xiàn)并有效治療腫瘤，為老年結(jié)直腸癌患者提供更多的生存機(jī)會(huì)。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt(一類分泌型糖蛋白)信號(hào)通路中的一個(gè)重要組成分子，參與多種器官的形成，其表達(dá)失調(diào)是結(jié)直腸腫瘤形成的關(guān)鍵因素之一[2]。大多數(shù)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中β-catenin過表達(dá)，但在結(jié)直腸癌侵襲前的細(xì)胞核內(nèi)β-catenin也表達(dá)增加，同時(shí)伴有一定程度的胞內(nèi)彌漫表達(dá)[3]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是誘導(dǎo)生存素(survivin)表達(dá)的關(guān)鍵因子[4]。survivin是凋亡家族中的抑制因子，在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，是很好的腫瘤診斷和治療候選基因，參與腫瘤相關(guān)的多種功能調(diào)節(jié)，包括腫瘤細(xì)胞生長、凋亡和放療抵抗等[5-7]，因此針對survivin的靶向治療是腫瘤基因治療的一個(gè)方向。目前β-catenin和survivin蛋白在老年結(jié)直腸腺癌中的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測老年結(jié)直腸腺癌組織中β-catenin和survivin蛋白的表達(dá)情況，分析二者與性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-lymph node-metastasis,TNM)分期之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2015年1月至2017年12月在長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院及和濟(jì)醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除治療的結(jié)直腸腺癌患者50例，其中男性25例，女性25例，年齡65～78(68.4±2.7)歲，根據(jù)第8版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)結(jié)直腸癌分期進(jìn)行TNM分期[8]：Ⅰ期5例、Ⅱ期10例、Ⅲ期29例、Ⅳ期6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸腺癌；(2)術(shù)前均未接受過放療、化療、靶向治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)直腸腺癌家族史；(2)腫瘤史。將外科手術(shù)切除后的標(biāo)本分為2組：癌組織組和正常組織組(距離癌組織邊緣>2 cm，病理檢測結(jié)果正常)，每組50例。

1.2 主要試劑與儀器

β-catenin抗體購自SANTA CRUZ公司，survivin抗體購自Abcam公司，相應(yīng)的二抗、通用型二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒等均購自北京中杉金橋公司。萊卡石蠟切片機(jī)(德國Leica RM2235)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用10%福爾馬林固定組織，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，逐級脫蠟脫水后，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后滴加正常的非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育10 min。每張玻片加50 μl的稀釋一抗，將其置于密封濕盒中4℃過夜，PBS沖洗后，加二抗室溫孵育20 min，PBS沖洗后二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。切片判讀由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立完成，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，染色強(qiáng)度評分：不顯色或顯色不清為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占百分比評分：未見陽性細(xì)胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述兩項(xiàng)評分相加為總評分，0分為陰性(-)，1～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，≥6分為強(qiáng)陽性(+++)。總分值<3分的視為陰性表達(dá)，總分值≥3分視為陽性表達(dá)[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分率)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。Spearman相關(guān)分析β-catenin蛋白表達(dá)與survivin蛋白表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 β-catenin和survivin蛋白在癌組織組和正常組織組的表達(dá)

在正常組織組中，β-catenin和survivin蛋白均呈陰性表達(dá)，陽性表達(dá)率均為0.0%(0/50)；在癌組織組中，β-catenin和survivin蛋白陽性表達(dá)率分別為64.0%(32/50)和54.0%(27/50)，均顯著高于正常組織組(P<0.001)。β-catenin在老年結(jié)直腸腺癌細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞核均可呈陽性表達(dá)，在正常組織細(xì)胞膜弱陽性表達(dá)；survivin在老年結(jié)直腸腺癌細(xì)胞核呈陽性表達(dá)，在正常組織細(xì)胞核陰性表達(dá)(圖1)。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測2組β-catenin和survivin表達(dá)Figure 1 Detection of β-catenin and survivin in two groups by immunohistochemistry (DAB ×40)A:expression of β-catenin in normal tissue group;B:expression of β-catenin in cancer tissue group;C:expression of survivin in normal tissue group;D:expression of survivin in cancer tissue group.

2.2 β-catenin和survivin蛋白表達(dá)與老年結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系

β-catenin表達(dá)與老年結(jié)直腸腺癌患者的性別無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期相關(guān)(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌患者β-catenin表達(dá)增高，TNM分期越晚的患者β-catenin表達(dá)越高。survivin蛋白表達(dá)與老年結(jié)直腸腺癌患者的性別和TNM分期無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌患者survivin蛋白表達(dá)高(表1)。

2.3 β-catenin蛋白表達(dá)與survivin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，老年結(jié)直腸腺癌患者的β-catenin蛋白表達(dá)與survivin蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.645，P<0.001)。

表1 β-catenin和survivin蛋白表達(dá)與老年結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between the expression of β-catenin and survivin and the clinicopathologic features in elderly colorectal cancer patients

3 討 論

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，年齡是與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的高危因素。美國國立衛(wèi)生研究院將全球結(jié)直腸癌患者分為<50歲、50～64歲和>65歲3組進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，在亞洲人群中，>65歲者結(jié)直腸癌患病率最高[10]。因此，老年結(jié)直腸腺癌患者診斷和治療方法亟待進(jìn)一步提高，探索老年結(jié)直腸腺癌患者中有意義的差異表達(dá)蛋白，可為臨床診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。

研究表明，90%以上的結(jié)直腸癌患者中存在Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的激活，Wnt信號(hào)通路是參與結(jié)直腸癌診斷和治療的重要通路之一[11,12]。β-catenin是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路中重要的分子，在結(jié)直腸癌侵襲前的細(xì)胞核內(nèi)即可檢測到β-catenin高表達(dá)，可使癌細(xì)胞具備上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變能力，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果表明，老年癌組織中β-catenin蛋白表達(dá)增加，而且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的β-catenin蛋白表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNM分期越晚的患者β-catenin表達(dá)越高。提示β-catenin參與了老年結(jié)直腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展，并且可能和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。

survivin是細(xì)胞凋亡基因家族的抑制蛋白，在成人正常組織中低表達(dá)，在大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)。survivin高表達(dá)與腫瘤的生長、治療抵抗等密切相關(guān)。survivin可通過抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和caspase-9抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，加速腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]，通過抑制Fas(細(xì)胞凋亡相關(guān)的膜表面分子)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制免疫系統(tǒng)[15]。survivin具有抗凋亡和破壞免疫系統(tǒng)等作用，是很好的腫瘤基因治療靶標(biāo)。有證據(jù)表明，在大多數(shù)惡性腫瘤中，細(xì)胞毒性化療藥物和survivin的表達(dá)之間存在著某種聯(lián)系，靶向阻斷survivin結(jié)合化療和放療，可以減少化療耐藥和放療抵抗[16]。本研究結(jié)果顯示，老年癌組織中survivin表達(dá)增加，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的survivin表達(dá)更高，提示survivin和老年患者結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為老年結(jié)直腸腺癌診斷和治療的靶標(biāo)。

一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌的研究數(shù)據(jù)顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑Wnt抑制子1(inhibitors of Wnt response-1，IWR-1)可通過降解survivin來抑制β-catenin參與的結(jié)直腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年結(jié)直腸腺癌患者β-catenin蛋白表達(dá)與survivin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。提示β-catenin和survivin蛋白可能共同促進(jìn)老年結(jié)直腸腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入研究老年結(jié)直腸腺癌患者β-catenin和survivin蛋白之間具體的相互調(diào)控關(guān)系及可能的作用機(jī)制，為老年結(jié)直腸腺癌患者診斷和聯(lián)合靶向治療提供參考。