張少紅 陳國芳 劉超

[摘要] 熱量限制在延緩衰老、抗癌、治療糖尿病等慢性代謝疾病的作用顯著，目前熱量限制的方案并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，具有明顯爭議。限食的時間長短、組份、喂養(yǎng)的時間段不同，動物的種類等都可能影響實驗的結(jié)果，本文就熱量限制過程中的相關(guān)影響因素進行綜述。

[關(guān)鍵詞] 嚙齒動物；熱量限制；方案；影響因素

[中圖分類號] R376 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（b）-0157-04

The matters need attention of calorie restriction in rodents

ZHANG Shaohong CHEN Guofang LIU Chao

Department of Endocrinology， Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210028， China

[Abstract] Calorie restriction has a significant role in delaying aging， anti-cancer， and treating chronic metabolic diseases such as diabetes. Currently， there is no uniform standard scheme for calorie restriction programs， which is obviously controversial. The length of time， the composition of food， the feeding time and the type of animal may affect the results of the experiment. This paper reviews the relevant influence factors in the process of calorie restriction.

[Key words] Rodents； Calorie restriction； Scheme； Influence factors

熱量限制（calorie restriction，CR）是一種能量攝入減少（一般將攝入量減少15%～40%），但保證具有足夠營養(yǎng)的供應(yīng)，亦稱限食。適度的限食緩解了與2型糖尿病、心血管疾病和癌癥等的發(fā)病有關(guān)的多種代謝問題[1]。限食的的形式各樣，根據(jù)食物種類可分為低熱量、低碳水化合物、低脂限食等；根據(jù)時間可分為短期限食（一般7～9 d），長期限食（>9 d）[2]；根據(jù)限制程度，可分為低熱量限食和極低熱量限食[3]；根據(jù)限食頻率可分為連續(xù)性限食、間歇性限食。限食的方案目前并沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，以上幾種的限食方法在臨床和動物研究中均有應(yīng)用。限食的具體程度不一、形式多樣，不斷發(fā)展的限食模式雖日趨成熟，但仍有一些問題應(yīng)該引起注意：①限食的時間需要多長才能有效？②基因型和性別對限食有什么影響？③限食過程喂養(yǎng)的計劃有多重要？④飲食組份起什么作用？

1 限食多久是有效的？

大多數(shù)關(guān)于CR的研究都是先進行長期治療（>9 d），觀察其保護機體損傷、改善糖脂代謝，抵抗肥胖、糖尿病，延緩衰老等的機制。有學(xué)者[4]將CR的干預(yù)措施定義為從1 d到幾個月不等。長期限食的效果毋庸置疑，如Park等[5]報道了30%CR持續(xù)4～6周，提高了葡萄糖耐量和胰島素敏感性；16周CR后小鼠中認(rèn)知表現(xiàn)更好[6]；在小鼠CR后4周發(fā)現(xiàn)腦中炎性反應(yīng)改善[7]；在對高脂喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠限食8周后發(fā)現(xiàn)其并發(fā)癥明顯減少[8]。但短期甚至幾天的時間熱量限制對疾病的治療也是有益的。有研究表明限食可以減輕神經(jīng)元損傷，還可增加對大鼠缺血性中風(fēng)的保護作用[9-10]。Longo等[11]發(fā)現(xiàn)短期限食和禁食對小鼠體內(nèi)化療的具有有益作用。Perry[12]通過短期（3 d）低熱量飲食（正常組攝入量的1/4）發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠糖代謝、肝臟的胰島素抵抗明顯改善。以往所認(rèn)為的限食，多以長期為主，在短期的干預(yù)中也取得了明顯的效果，若應(yīng)用于肥胖等代謝疾病的治療，雖具有重要意義，但不得不考慮在短期干預(yù)結(jié)束后，會不會帶來更嚴(yán)重的體重反彈等問題。

2 基因型和性別對CR的影響

大多數(shù)關(guān)于CR對小鼠壽命和死亡率影響的數(shù)據(jù)都認(rèn)為在熱量限制和壽命增加存在接近線性的關(guān)系，近年來，這一公認(rèn)的CR原則受到了質(zhì)疑，特別是關(guān)于CR可對同一物種甚至菌株具有普遍延長壽命的的觀點。在一項對1934～2012年進行的研究中使用數(shù)據(jù)的Meta分析表明CR在小鼠中的壽命延長效應(yīng)為4%～27%，并且這些結(jié)果在重組近交系小鼠中比較不理想。Liao等[13]的實驗對小鼠的ilsxiss重組自交系進行壽命分析，發(fā)現(xiàn)CR對生存的影響依賴于菌株和性別，為CR的反應(yīng)在生存方面存在差異提供了有力的證據(jù)。有研究使用DBA/2J小鼠的不同性別和兩種CR水平（20%和40%），并發(fā)現(xiàn)當(dāng)維持在40%CR時，DBA雌性的最大壽命增加37.3%，雄性增加29.8%[14]。然而，40%的CR對B6雌性的存活率有不利影響。這些結(jié)果表明基因型、性別和CR等級之間有很強的相互作用。識別可以預(yù)測個體應(yīng)變和性別的反應(yīng)性或缺乏反應(yīng)性的特定生物標(biāo)志物，可以使我們對CR的潛在機制更好的了解。

3 喂養(yǎng)時間表的重要性

在過去的幾十年里，人們一直在爭論熱量的實際減少是否對提高CR治療肥胖、糖尿病和抗衰老等的能力是必要的，又或者限食的模式是否通過改變了喂食時間表，而不是直接的能量消耗產(chǎn)生有益的效果。一直以來研究較多的是每日限食，在喂養(yǎng)的時間點的問題上，主要是間歇性能量限制（intermittent energy restriction，IER）和限時喂養(yǎng)（time-restricted feeding，TRF）兩種形式。

3.1 IER

一般來說，間歇性能量限制是指定期減少或消除能量的攝入，包括隔日限食（每隔1 d進行限食）、每周限食2～3 d（或?qū)z入能量控制在每周正常飲食水平的1/4以下）等形式。許多研究，實行IER方案，結(jié)果顯示確實對機體代謝具有明顯改善作用，可產(chǎn)生明顯的有益影響。Wan等[15]是第一個證明在幼鼠（SD）中使用隔日限食喂養(yǎng)6個月可降低血壓和心率。Tikoo等[16]使用隔日限食方案8周后觀察到其具有保護腎臟和降低高血壓的效果。Belkacemi等[17]研究表明，間歇限食可以通過保護胰腺細(xì)胞來改善1型糖尿病大鼠的胰島素缺乏和葡萄糖耐受不良。盡管具體的機制尚未明確，可能是通過使細(xì)胞應(yīng)激耐受性增強來對β細(xì)胞進行保護[18]。而有一些實驗室已經(jīng)開始探索間斷限食的新方案，比如Brandhorst等[19]提出了“限食模擬飲食”（fastingmimicking diet，F(xiàn)MD），肥胖小鼠予以FMD飲食喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)脂肪、體重明顯減少，癌癥發(fā)病率顯著降低，生存率提高。在嚙齒動物模型中間斷限食，在改善肥胖小鼠的糖脂代謝、生存質(zhì)量等方面具有重要作用。

3.2 限時喂養(yǎng)（TRF）

間斷限食是以天數(shù)為間隔，限時喂養(yǎng)這種類型的飲食方案是指限制每天攝入熱量在一定的時間內(nèi)完喂食（如4～6 h內(nèi)）。在肥胖的許多研究支持限食喂養(yǎng)對健康是有積極意義的。Duncan[20]發(fā)現(xiàn)HFD（60%脂肪）與低脂（10%脂肪）和HFD并且限飼8 h喂養(yǎng)時，限時喂養(yǎng)小鼠體重和肝臟重量減輕，葡萄糖耐量改善。Belkacemi等[21]研究HFD喂養(yǎng)的沙鼠產(chǎn)生胰島素抵抗和糖尿病，但可以通過每天8 h的限時喂養(yǎng)來改善糖尿病。同樣，其他研究[22-23]證明當(dāng)對C57BL/6J小鼠HFD（61%脂肪）每天8 h的限時喂養(yǎng)，限時喂養(yǎng)組的熱量攝入量與正常喂養(yǎng)組的卻沒有差別，但肝脂肪變性減少，肥胖、高胰島素血癥均得到改善。限時間段的飼養(yǎng)似乎是這些方案的獲益的一個關(guān)鍵因素。Haraguchi等[24]在HFD的小鼠上檢查了各種限時的時間方案。當(dāng)在光照或黑暗期間將攝食限制在4 h，在熱量攝入不受影響的情況下，體重和脂肪也會減少。TRF的飲食模式雖然在延緩衰老方面的還沒有充分研究，但在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)代謝疾病中的有益作用是不容忽視的。

4 飲食構(gòu)成的作用

動物中進行熱量限制比想象中更復(fù)雜一些，如何貫徹實施CR飲食已經(jīng)成為嚙齒動物研究中的一個重要問題。大部分已發(fā)表的飲食組份研究都是在短期的嚙齒動物模型中進行的，但結(jié)果并不一致。如Halade等[25]觀察在飼喂含有魚油的飼料的小鼠與玉米油相比壽命增加，但Tsuduki等[26]的研究結(jié)果是降低的，與之截然相反。CR研究的標(biāo)準(zhǔn)方法，是向?qū)φ談游镫S意提供食物，實驗組予以定量的食物，如果沒有補充必需的營養(yǎng)素，限食組就可能營養(yǎng)不良而影響實驗結(jié)果。我們這里重點討論宏觀營養(yǎng)素，特別是蛋白質(zhì)。涉及飲食中蛋白質(zhì)特異性降低的研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動物的反應(yīng)與CR喂養(yǎng)的動物相似[27]。然而，早期報告大部分都表明，操縱宏觀和微觀營養(yǎng)成分對生存沒有重大影響。最近的一些研究已經(jīng)在小鼠研究中提供了高度系統(tǒng)的蛋白質(zhì)含量控制[28]。例如，40%的蛋白質(zhì)限制飲食（protein restriction，PR）時，兩組在保持非常相似的熱量攝入的情況下，出現(xiàn)了CR對大鼠線粒體ROS產(chǎn)生和氧化損傷的影響。但當(dāng)減少其他常量營養(yǎng)素時，并沒有出現(xiàn)上述的影響，可能是因為蛋白質(zhì)或氨基酸在熱量攝入中的特殊作用所導(dǎo)致的[29-30]。Speakman等[31]對PR與CR的發(fā)展歷史和爭議進行了全面整體的分析，限食對嚙齒動物壽命的作用是由于總熱量減少，而不是蛋白質(zhì)或任何其他宏觀營養(yǎng)素所導(dǎo)致。在嚙齒動物研究中關(guān)于蛋白質(zhì)飲食限制也是極具爭議性，但總體來說，總熱量的減少對改善動物的代謝情況、延緩衰老有重要意義。

5 小結(jié)

當(dāng)然，除上述問題之外，限食也要注意其他的負(fù)面影響，可能對骨骼，傷口愈合和某些免疫反應(yīng)有不利影響。在限食的動物的不同品系、方案、喂養(yǎng)的時間段等的選擇，都可能影響實驗的結(jié)果。但有一點是明確的，在慢性代謝疾病中限食是一個需要長期堅持并且效果顯著的治療方式。

[參考文獻]

[1] Most J，Tosti V，Redman LM，et al. Calorie restriction in humans：an update [J]. Ageing Res Rev，2017，39：36-45.

[2] 陳國芳，劉超.對限食療法的新認(rèn)識[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2013，29（4）：269-272.

[3] 李春睿，徐書杭，蔡可英，等.限食療法對2型糖尿病的預(yù)防和治療作用[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志，2014，34（2）：123-126.

[4] Robertson LT，Mitchell JR. Benefits of short-term dietary restriction in mammals [J]. Exp Gerontol，2013，48（10）：1043-1048.

[5] Park S，Komatsu T，Hayashi H，et al. Calorie restriction initiated at middle age improved glucose tolerance without affecting age-related impairments of insulin signaling in rat skeletal muscle [J]. Exp Gerontol，2006，41（9）：837-845.

[6] Sarker MR， Franks S，Sumien N，et al. Curcumin mimics the neurocognitive and anti-inflammatory effects of caloric restriction in a mouse model of midlife obesity [J]. PLoS One，2015，10（10）：e0140431.

[7] Dhurandhar EJ，Allison DB，Van GT，et al. Hunger in the absence of caloric restriction improves cognition and attenuates Alzheimer′s disease pathology in a mouse model [J]. PLoS One，2013，8（4）：e60437.

[8] Tikoo K，Tripathi DN，Kabra DG，et al. Intermittent fasting prevents the progression of type Ⅰ diabetic nephropathy in rats and changes the expression of Sir2 and p53 [J]. Febs Letters，2007，581（5）：1071-1078.

[9] Marie C，Bralet AM，Gueldry S，et al. Fasting prior to transient cerebral ischemia reduces delayed neuronal necrosis [J]. Metab Brain Dis，1990，5（2）：65-75.

[10] Chiba T，Ezaki O. Dietary restriction suppresses inflammation and delays the onset of stroke in stroke-prone spontaneously hypertensive rats [J]. Biochem Biophys Res Commun，2010，399（1）：98-103.

[11] Longo VD，Panda S. Fasting，circadian rhythms，and time-restricted feeding in healthy lifespan [J]. Cell Metab，2016，23（6）：1048-1059.

[12] Perry RJ，Peng L，Cline GW，et al. Mechanisms by which a very-low-calorie diet reverses hyperglycemia in a rat model of type 2 diabetes [J]. Cell Metab，2017，27（1）：210.

[13] Liao CY，Rikke BA，Johnson TE，et al. Fat maintenance is a predictor of the murine lifespan response to dietary restriction [J]. Aging Cell，2011，10（4）：629-639.

[14] Mitchell SJ，Matute JM，Scheibyeknudsen M，et al. Effects of sex， strain， and energy intake on hallmarks of aging in mice [J]. Cell Metab，2016，23（6）：1093-1112.

[15] Wan R，Camandola S，Mattson MP. Intermittent fasting and dietary supplementation with 2-deoxy-D-glucose improve functional and metabolic cardiovascular risk factors in rats [J]. Faseb J，2003，17（9）：1133-1134.

[16] Tikoo K，Tripathi DN，Kabra DG，et al. Intermittent fasting prevents the progression of type I diabetic nephropathy in rats and changes the expression of Sir2 and p53 [J]. Febs Lett，2007，581（5）：1071-1078.

[17] Belkacemi L，Selseletattou G，Hupkens E，et al. Intermittent fasting modulation of the diabetic syndrome in streptozotocin-injected rats [J]. Int J Endocrinol，2011，2012（2）：962012.

[18] Mattson MP. Lifelong brain health is a lifelong challenge：from evolutionary principles to empirical evidence [J]. Ageing Research Reviews，2015，20：37-45.

[19] Brandhorst S，Choi IY，Wei M，et al. A periodic diet that mimics fasting promotes multi-system regeneration， enhanced cognitive performance，and healthspan [J]. Cell Metab，2015，22（1）：86.

[20] Duncan MJ，Smith JT，Narbaiza J，et al. Restricting feeding to the active phase in middle-aged mice attenuates adverse metabolic effects of a high-fat diet [J]. Physiol Behav，2016，167：1-9.

[21] Belkacemi L，Selselet-Attou G，Louchami K，et al. Intermittent fasting modulation of the diabetic syndrome in sand rats. II. In vivo investigations [J]. Int J Mol Med，2010，26（5）：759-765.

[22] Hatori M，Vollmers C，Zarrinpar A，et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet [J]. Cell Metab，2012， 15（6）：848-860.

[23] Hattori S，Park JH，Agata U，et al. Food restriction causes low bone strength and microarchitectural deterioration in exercised growing male rats [J]. J Nutr Sci Vitaminol （Tokyo），2014，60（1）：35-42.

[24] Haraguchi A，Aoki N，Ohtsu T，et al. Controlling access time to a high-fat diet during the inactive period protects against obesity in mice [J]. Chronobiol Int，2014，31（8）：935-944.

[25] Halade GV，Rahman MM，Bhattacharya A，et al. Docosahexaenoic acid-enriched fish oil attenuates kidney disease and prolongs median and maximal life span of autoimmune lupus-prone mice [J]. J Immunol，184（9）， 5280-5286.

[26] Tsuduki T，Honma T，Nakagawa K，et al. Long-term intake of fish oil increases oxidative stress and decreases lifespan in senescence-accelerated mice [J]. Nutrition，2011，27（3）：334-337.

[27] Cerqueira FM，Kowaltowski AJ. Commonly adopted caloric restriction protocols often involve malnutrition [J]. Ageing Res Rev，2010，9（4）：424-430.

[28] Couteur DGL，Solonbiet S，Wahl D，et al. New Horizons：Dietary protein， ageing and the Okinawan ratio [J]. Age Ageing，2016，45（4）：443-447.

[29] Ayala V，Naudí A，Sanz A，et al. Dietary protein restriction decreases oxidative protein damage， peroxidizability index，and mitochondrial complex I content in rat liver [J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2007，62（4）：352-360.

[30] Sanz A，Caro P，Ayala V，et al. Methionine restriction decreases mitochondrial oxygen radical generation and leak as well as oxidative damage to mitochondrial DNA and proteins [J]. Faseb J，2006，20（8）：1064-1073.

[31] Speakman JR，Mitchell SE，Mazidi M. Calories or Protein？ The effect of dietary restriction on lifespan in rodents is explained by calories alone [J]. Exp Gerontol，2016， 86：28-38.

（收稿日期：2018-09-29 本文編輯：蘇 暢）