銀慧慧 劉偉 趙武

[摘要] 目的 探討桃金娘根總多酚的超聲提取工藝條件及其抗氧化活性。 方法 采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)桃金娘根總多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；采用福林酚試劑法在紫外-可見分光光度計(jì)下對(duì)桃金娘根總多酚的吸光度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其提取得率。采用1，1-二苯-2-苦基肼自由基（DPPH·）清除率和總抗氧化活性能力對(duì)桃金娘根總多酚的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果 最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度60℃，提取時(shí)間50 min，在此條件下提取得率達(dá)78.03 mg/g；桃金娘根總多酚的總抗氧化活性和DPPH·清除率均高于抗壞血酸。 結(jié)論 超聲提取適用于桃金娘根總多酚的提取；桃金娘根總多酚為一種天然的抗氧化活性劑和自由基清除劑。

[關(guān)鍵詞] 桃金娘根；總多酚；超聲提取；正交試驗(yàn)；抗氧化活性

[中圖分類號(hào)] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）04（a）-0033-04

Ultrasonic extraction and antioxidant activity of total polyphenols from Myrtle root

YIN Huihui1 LIU Wei1 ZHAO Wu1 YANG Wuning2 MENG Fei1 JIANG Yuanming1 QIN Zhenhua1 SUN Jianhua1

1.Guangxi Veterinary Research Institute Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China； 2.Guangxi Veterinary Drug Control Institute， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To study the ultrasonic extraction technology and antioxidant activity of total polyphenols from the root of Myrtle. Methods The extraction process of total polyphenols from the root of Myrtle was optimized by single factor and orthogonal experiment， and the absorbance of total polyphenols from the root of Myrtle was determined by Foline reagent under ultraviolet-visible spectrophotometer， and the extraction yield was calculated. The antioxidant activity was evaluated by 1，1-Diphyeny1-2-picrylhydrazyl free radical （DPPH·） scavenging rate and total antioxidant activity test. Results The optimum extraction conditions were ethanol concentration 60%， solid-liquid ratio 1∶40 （g/mL）， extraction temperature 60℃， extraction time 50 min. Under these conditions， the extraction yield was 78.03 mg/g. The total antioxidant activity and DPPH· scavenging rate of total polyphenols in the root of Myrtle were higher than that of ascorbic acid. Conclusion Ultrasound extraction is suitable for the extraction of total polyphenols from the root of Myrtle， which is a natural antioxidant and free radical scavenger.

[Key words] Root of Myrtle； Total polyphenols； Ultrasound extraction； Orthogonal test； Antioxidant activity

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）屬于熱帶性氣候指示性植物，是一種優(yōu)良的野生藥用植物資源[1-2]，具有較高的醫(yī)藥及保健價(jià)值，廣泛分布在中國和日本的南部等地區(qū)[3]。桃金娘根是桃金娘的干燥根，富含黃酮類、三萜類、多糖類以及多酚類等多種活性成分，收載于《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品、中藥卷）第一冊(cè)》中[4]。已知多酚類化合物具有抗氧化性和抗腫瘤等作用[5]。因此，從桃金娘中提取總多酚化合物具有良好的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值和規(guī)模開發(fā)利用前景。目前，桃金娘的研究主要是集中在其果實(shí)的研究應(yīng)用[6-8]，而對(duì)桃金娘根多酚類化合物提取研究的報(bào)道較少。超聲提取具有提取效率高、操作簡(jiǎn)便、低耗、提取周期短、提取條件穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在植物活性成分開發(fā)和利用中已得到了廣泛應(yīng)用[9]。

本研究對(duì)桃金娘根總多酚的超聲提取工藝條件進(jìn)行了分析和優(yōu)化，并采用1，1-二苯-2-苦基肼自由基（DPPH·）清除率和總抗氧化活性能力評(píng)價(jià)桃金娘根總多酚的抗氧化活性，旨在為桃金娘根中有效成分的提取以及桃金娘根的藥用價(jià)值和保健作用的深入開發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

UV2550紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）、Milli-Q超純水儀（Millipore公司）、F160型粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、SQP型（精度0.01 mg）電子天平（德國Sartorious公司）、CAP225D型電子天平（精度0.1 mg，德國Sartorious公司）、SK7200HP型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 主要試藥

沒食子酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：89.9%，批號(hào)：110831-201605）、1，1-二苯-2-苦基肼自由基（AR，sigma公司，批號(hào)：EKKS1297）、Foline-Ciocalteu試劑0.5 mol/L（上海荔達(dá)生物科技有限公司）、試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水均為超純水。

桃金娘根購自廣西太華醫(yī)藥有限公司（產(chǎn)地：南寧），經(jīng)廣西植物所溫放副研究員鑒定為Radix Rhodomyrti。

2 方法與結(jié)果

2.1 桃金娘根總多酚的提取

取適量桃金娘根，粉碎，過五號(hào)篩，精密稱取適量細(xì)粉，置100 mL具塞錐形瓶?jī)?nèi)，按一定的料液比加入適量的乙醇溶液，按不同的因素水平進(jìn)行超聲提取（350 W，53 kHz），放冷，過濾，得到的粗提液置于4℃冰箱中備用。

2.2 桃金娘根總多酚測(cè)定方法

采用福林酚試劑，并通過紫外-分光光度法[10]進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取沒食子酸對(duì)照品12.04 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，水溶解并定容至刻度，得到濃度為108.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液置25 mL棕色容量瓶中，加入5 mL水，隨后加入1.0 mL福林酚試劑，充分搖勻，靜置1 min后，加入2.5 mL濃度為20%的Na2CO3溶液，水定容至刻度，于25℃下避光反應(yīng)90 min后在分光光度計(jì)下于748 nm波長處測(cè)定其吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性回歸分析后得到的線性方程為：Y= 0.1025X + 0.08（R2 = 0.9949）。

2.2.3 樣品總多酚的測(cè)定 精密吸取待測(cè)供試液1.0 mL置50 mL棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。再精密量取稀釋后的供試液1.0 mL于25 mL棕色容量瓶中，其余按“2.2.2”方法測(cè)定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計(jì)算提取得率[11]。

多酚提取得率（mg/g）=供試品多酚質(zhì)量（mg）/桃金娘根原料質(zhì)量（g）

2.3 桃金娘根總多酚提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

桃金娘根總多酚提取的單因素試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[12]。

2.3.1 提取溶劑濃度對(duì)桃金娘根總多酚提取得率的影響 精密稱取1 g桃金娘根細(xì)粉，置100 mL 具塞錐形瓶?jī)?nèi)，固定料液比1∶10（g/mL），分別加入不同濃度乙醇溶液，超聲（350 W，53 kHz，30℃）提取30 min，過濾，取相應(yīng)濃度乙醇溶液定容于100 mL棕色容量瓶中，充分搖勻，其余按“2.2.2”方法測(cè)定其吸光度并計(jì)算總多酚含量。結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度的增加，多酚類化合物受到高濃度乙醇中親脂性強(qiáng)的成分影響[13]，使得提取率下降，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)具有最大提取得率。

2.3.2 料液比對(duì)桃金娘根總多酚提取得率的影響 精密稱取1 g桃金娘根細(xì)粉，置100 mL具塞錐形瓶?jī)?nèi)，固定提取溶劑乙醇濃度60%，改變料液比，其余步驟及測(cè)定方法同“2.2.1”。結(jié)果顯示，受料液比的影響[14]，當(dāng)料液比超過1∶30（g/mL）時(shí)，桃金娘根總多酚的提取得率的增加變化較小。因此，選擇料液比1∶30（g/mL）進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 提取溫度對(duì)桃金娘根總多酚提取得率的影響 精密稱取1 g桃金娘根細(xì)粉，置于100 mL 具塞錐形瓶?jī)?nèi)，固定提取溶劑乙醇濃度60%，料液比為1∶30（g/mL），改變提取溫度，其余步驟及測(cè)定方法同“2.3.1”。在溫度較高情況下，多酚類化合物穩(wěn)定性降低[15]，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，總多酚的提取得率最高。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)桃金娘根總多酚提取得率的影響 精密稱取1 g桃金娘根細(xì)粉，置100 mL具塞錐形瓶?jī)?nèi)，固定提取溶劑乙醇濃度60%，料液比1∶30（g/mL），提取溫度50℃，改變提取時(shí)間，其余步驟同“2.2.1”。當(dāng)提取時(shí)間超過50 min后，多酚類化合物可能發(fā)生氧化或聚合等反應(yīng)[16]，或由于熱效應(yīng)等影響[17]，使得提取得率下降。因此，選擇50 min為最佳提取時(shí)間。

2.4 桃金娘根總多酚提取的正交試驗(yàn)[18]

參考文獻(xiàn)[18]，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化桃金娘根總多酚的提取。

2.4.1 正交試驗(yàn)因素與水平 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇合適的乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）以及提取時(shí)間（D）進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。見表1。

2.4.2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果 各因素對(duì)桃金娘根總多酚提取得率的影響大小次序?yàn)椋篈>B>C>D，A2B3C3D2為極差分析得到的最優(yōu)提取條件組合，即乙醇濃度60%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度60℃，提取時(shí)間50 min。由于最佳提取工藝條件組合不在正交試驗(yàn)組合中，因此在最佳工藝條件下進(jìn)行3次提取平行試驗(yàn)，桃金娘根粗多酚提取物得率為78.03 mg/g，說明該工藝穩(wěn)定可行。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.5 桃金娘根總多酚抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 總抗氧化活性的測(cè)定 測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[19]。分別精密吸取0.2 mL不同濃度的桃金娘根總多酚提取液，并依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6，0.2 mol/L）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液（m/v），搖勻，于50℃水浴振蕩20 min，冰浴冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸（m/v），充分搖勻后精密吸取混液2.5 mL，再加入2.5 mL的水和0.1%氯化鐵溶液（m/v），混合均勻，靜置10 min，在700 nm波長處測(cè)定吸光度，記為A，以水代替提取液按照上述步驟作為空白并測(cè)定其吸光度，記為A0?？偪寡趸钚钥梢杂忙來表示，（ΔA=A-A0），ΔA越大，說明其總抗氧化活性越強(qiáng)?？箟难崛芤旱目偪寡趸钚詼y(cè)定步驟同上。隨著總多酚和抗壞血酸濃度的增加吸光值也逐漸增大，總抗氧化活性能力逐漸增強(qiáng)。見圖1。

2.5.2 DPPH·清除率的測(cè)定 測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[20]。依次精密吸取2×10-4 mol/L DPPH·溶液2 mL和不同濃度的提取液2 mL置于25 mL的比色管中，搖勻避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長下測(cè)定吸光度A，以2 mL無水乙醇代替提取液按照上述步驟反應(yīng)作為空白，其吸光度為A0。清除率按下式進(jìn)行計(jì)算：DPPH·的清除率（%）=（1-A/A0）×100%?？箟难崛芤旱腄PPH·清除率測(cè)定步驟同上。桃金娘根總多酚對(duì)DPPH·的清除能力隨總多酚濃度增高而增大。見圖2。

3 討論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)，探索桃金娘根總多酚超聲提取的最佳工藝：乙醇濃度60%，料液比1∶40（g/mL），提取溫度60℃，提取時(shí)間50 min，桃金娘根粗多酚的提取得率達(dá)78.03 mg/g。該方法具有操作簡(jiǎn)便、低耗、提取率高、污染小、提取條件穩(wěn)定以及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于桃金娘根總多酚的提取。此外，在本研究實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，相同濃度下，桃金娘根總多酚的總抗氧化活性能力以及對(duì)DPPH·的清除能力優(yōu)于抗壞血酸溶液。

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（收稿日期：2018-06-20 本文編輯：王 蕾）