劉冉 ，葛魯鄒 ，張海東 ，趙東 ，侯偉良 ，鄂曉霏 ，于天水

（1.司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國政法大學 證據(jù)科學教育部重點實驗室，北京 100192；3.威海市公安局高區(qū)分局，山東 威海 264200）

骨骼肌分布廣泛，是暴力損傷中極易受累的器官，因而在實踐中骨骼肌損傷發(fā)生率較高，是鑒定實踐中常見的損傷類型。骨骼肌損傷修復機制、骨骼肌損傷形成時間以及骨骼肌損傷程度判斷一直受到法醫(yī)學工作者重視。其中骨骼肌損傷形成時間推斷對刑事案件偵查具有重要意義，然而，準確地推斷骨骼肌損傷時間一直是法醫(yī)學鑒定中的難題。本課題組前期相關研究[1]未考慮死后環(huán)境因素（溫度與濕度）對所研究指標的影響，亦未考慮所研究指標分別在生前傷和死后傷中的表達情況。鑒于以上問題，本課題組將尋找參與骨骼肌損傷修復過程、死后表達具有良好的時間相關性以及可以鑒別生前傷與死后傷的指標，擬建立推斷骨骼肌損傷時間相關參考指標的數(shù)據(jù)庫，利用多指標對法醫(yī)學實踐中的骨骼肌損傷時間進行準確推斷。

轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是成纖維細胞的主要趨化因子，是直接誘導成纖維細胞（fibroblast）向肌成纖維細胞（myofibroblast）轉(zhuǎn)化最重要的細胞因子[2]。在正常損傷愈合和病理狀態(tài)下，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）通過刺激TGF-β1的產(chǎn)生來誘導α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）在肌成纖維細胞中合成，導致富含該細胞的肉芽組織形成[3]。但TGF-β1發(fā)揮作用還受到細胞外基質(zhì)條件和細胞表面受體的限制。其中，纖連蛋白EⅢA片段（EⅢA-fibronectin，EⅢA-FN）是TGF-β1誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的關鍵分子[4]。選擇性封閉EⅢA會阻礙TGF-β1誘導α-SMA的產(chǎn)生，但EⅢA及FN自身并不能誘導α-SMA的表達。EⅢA序列能引起FN構象的改變，增加FN與其細胞表面黏附受體整合素結(jié)合的機會，后者激發(fā)基質(zhì)信號的轉(zhuǎn)導途徑，可增加細胞對TGF-β1的敏感性[5]?？傊?，TGF-β1和EⅢA-FN參與了骨骼肌損傷后纖維化級聯(lián)反應的起始階段，與損傷時間具有良好的相關性。

因此，本研究擬在上述研究成果的基礎上，通過大鼠骨骼肌挫傷動物模型的建立，應用免疫組織化學染色和實時熒光定量PCR技術，分別研究生前損傷、生前損傷死后以及死后損傷不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN的分布與動態(tài)表達，旨在為法醫(yī)病理學損傷時間推斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組

健康成年雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量390～410g，隨機分為正常對照組（5只）、生前挫傷組（40只）、生前挫傷死后表達組（110只）和死后挫傷組（25只）。

正常對照組大鼠不予致傷。

生前挫傷組于8個時間點取材，分別為傷后6h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d，在預設的時間處死大鼠，當即取材，每個時間點5只大鼠。以正常對照組大鼠為對照。

生前挫傷死后表達組中，將55只傷后3d和55只傷后5d的大鼠處死后置于溫度為（25±2）℃、相對濕度為（60±5）%的臺式高低溫交變濕熱箱（多禾試驗設備有限公司）內(nèi)，分別于死后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、2d、3d、4d、5d、6d、7d進行取材，每個時間點5只大鼠，以死后0h大鼠為對照。傷后3d大鼠提取的所有死后組織均用于TGF-β1的實時熒光定量PCR檢測，傷后5 d大鼠提取的所有死后組織則用于EⅢA-FN的實時熒光定量PCR檢測。

死后挫傷組分別于大鼠死后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12h對其致傷，傷后立即取材，每個時間點5只大鼠，以正常對照組以及生前挫傷后6h、10d和14d處死的大鼠為對照。

1.2 大鼠骨骼肌挫傷模型的制作

本課題組前期已成功建立了大鼠骨骼肌挫傷模型[1]。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（30 mg/kg）麻醉，于右下肢剪毛備皮。將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用自制打擊器（質(zhì)量為500 g）打擊大鼠右下肢距跟骨2.5 cm處。此時，皮膚仍保持完整，脛腓骨無骨折，損傷后不給予任何處理，每只大鼠分籠飼養(yǎng)并給予飼料及水，保持墊料清潔及空氣通暢。

各挫傷組大鼠按預設時間點頸椎脫臼處死，取右下肢損傷區(qū)肌肉進行檢驗。正常對照組和生前挫傷組大鼠樣本一部分立即用4%多聚甲醛中性溶液固定1 d，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋及制作5 μm厚切片，用于免疫組織化學染色；另一部分立即提取RNA溶液3 μL，-80℃冰箱保存，用于實時熒光定量PCR檢測。生前挫傷死后表達組和死后挫傷組大鼠樣本僅進行實時熒光定量PCR檢測，處理同生前挫傷組。

1.3 免疫組織化學染色

切片脫蠟、水化，水煮修復后用3%過氧化氫溶液滅活，正常非免疫山羊血清孵育，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體（1∶100，sc-146，美國Santa Cruz公司）和小鼠抗大鼠 Fibronectin[IST-9]單克隆抗體（1∶200，ab6328，英國Abcam公司）分別作為一抗，應用免疫組織化學染色技術（SP法）進行染色，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素核復染。以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為空白對照。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄反應

按PrimeScriptTMRT試劑盒［DRR037S，寶生物工程（大連）有限公司］操作說明書，將1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。20 μL反應體系如下：已配好的RNA工作液（0.5 μg/μL） 2 μL、5×PrimeScriptTM緩沖液 4 μL、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄混合酶Ⅰ 1μL、寡聚胸腺嘧啶引物1μL、隨機的六核苷酸引物1μL、去RNA酶蒸餾水11 μL。放入2 mL薄壁PCR反應管中，瞬時離心混勻，置于PTC-100型PCR儀（美國MJ Research公司）中，37℃孵育15min（逆轉(zhuǎn)錄反應），85℃孵育5s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應）。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

應用PRISM?7500 Real-Time PCR System（美國AB公司），以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板在96孔板內(nèi)進行PCR擴增。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ［DRR081S，寶生物工程（大連）有限公司］試劑盒要求配制20 μL反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10μL、上游引物0.8μL、下游引物0.8μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA溶液2 μL、蒸餾水6 μL。所有引物均由寶生物工程（大連）有限公司設計，內(nèi)參基因RPL13、TGF-β1基因（Tgfb1）和EⅢA-FN基因（Fn1）的引物序列見表1。兩步法PCR擴增標準程序：95℃ 30s預變性；95℃ 5s，60℃ 34s，40個循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s，采集熒光信號，繪制熔解曲線。為了排除潛在污染，每次上機都用蒸餾水代替cDNA作為陰性對照。陰性對照未見擴增產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計學處理

實時熒光定量PCR結(jié)果由PRISM?7500 Real-Time PCR System自動采集給出目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，基因表達量采用 2-ΔΔCt進行計算，其中ΔΔCt=ΔCt實驗組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）－ΔCt對照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 正常對照組與生前挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN的免疫組織化學染色結(jié)果

正常對照組大鼠骨骼肌胞質(zhì)及間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞表達TGF-β1，骨骼肌胞質(zhì)內(nèi)弱表達EⅢA-FN。

傷后6 h，少量多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）和單個核細胞（mononuclear cell，MNC）分別微弱表達TGF-β1和EⅢA-FN。傷后12～24 h，大量PMN和MNC強表達TGF-β1和EⅢA-FN。傷后3～14 d，挫傷區(qū)開始出現(xiàn)成纖維樣細胞（fibroblastic cell，F(xiàn)BC）、新生血管及新生多核肌管，并且表達TGF-β1。而EⅢA-FN主要分布于細胞外基質(zhì)，并于傷后3～7d表達逐漸增多，之后表達減少。TGF-β1和EⅢA-FN的蛋白表達變化見圖1～2。

圖1 生前挫傷組大鼠骨骼肌不同時間點TGF-β1的表達（SP×400）

圖2 生前挫傷組大鼠骨骼肌不同時間點EⅢA-FN的表達（SP×400）

2.2 生前挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達

與正常對照組比較，生前挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1 mRNA的表達于傷后6 h輕微減少，而后逐漸增加，至3d達到峰值，再逐漸下降，至傷后10～14d接近正常對照組水平。其中，傷后3d，TGF-β1 mRNA的表達平均值為12.91，表達值范圍為11.84～14.03，高于其他時間點TGF-β1 mRNA的表達值（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

與TGF-β1 mRNA的表達趨勢相似，EⅢA-FN mRNA的表達亦于傷后6h減少，然后快速升高，于傷后5 d到達高峰，隨后下降，并于傷后10 d開始略低于對照組水平。其中，傷后5 d，EⅢA-FN mRNA的表達平均值為5.34，表達值范圍為4.26～6.21，其他時間點EⅢA-FN mRNA的表達值均低于4.26。經(jīng)統(tǒng)計，傷后5 d、7 d EⅢA-FN mRNA的表達與其他時間點之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 生前挫傷死后表達組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達

生前挫傷死后表達組中，和死后0h相比，TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達值分別于死后3h和6h開始增加，并分別于死后6h和12h達到峰值，然后逐漸下降至死后7 d。經(jīng)統(tǒng)計，死后不同時間點TGF-β1 mRNA的表達與死后0h之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；除死后3h、24h和2d外，其他時間點EⅢAFN mRNA的表達與死后0h之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

2.4 死后挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達

死后挫傷組中，死后0.5～12h TGF-β1和EⅢAFN mRNA的表達情況見表4。死后不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達值均明顯低于正常對照組及生前挫傷后6h、10d和14d處死的大鼠，而在死后不同時間點之間TGF-β1或EⅢA-FN mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 生前挫傷組大鼠骨骼肌不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達平均值及范圍 （n=5）

表3 生前挫傷死后表達組大鼠骨骼肌不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達平均值及范圍（n=5）

表4 死后挫傷組大鼠骨骼肌不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達平均值及范圍 （n=5）

3 討 論

本研究報道了大鼠骨骼肌生前挫傷后不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN的蛋白表達及mRNA動態(tài)變化趨勢，并探討了大鼠死后骨骼肌挫傷后不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達趨勢，研究了死后環(huán)境因素對于TGF-β1和EⅢA-FN mRNA表達的影響，為法醫(yī)學損傷時間推斷的研究提供了全新的視角。

本研究免疫組織化學染色結(jié)果顯示，TGF-β1蛋白主要定位于MNC和FBC，與大鼠皮膚切創(chuàng)肉芽組織中表達[6-7]一致。TGF-β1可以使巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），再通過IL-1β的繼發(fā)作用，參與局部炎癥反應?；罨蟮腡GF-β1主要通過整合素（integrin）/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、Smad3蛋白和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路誘導肌成纖維細胞分化[8-10]。肌成纖維細胞具有發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可以分泌大量的細胞外基質(zhì)，包括Ⅰ～Ⅵ型膠原等。但是EⅢAFN蛋白表達明顯不同于TGF-β1蛋白，除了損傷早期其位于炎癥細胞的胞質(zhì)內(nèi)，傷后3～7d主要表達于細胞外基質(zhì)，也與大鼠皮膚挫傷后EⅢA-FN蛋白的表達[11]基本相同。細胞外基質(zhì)表達EⅢA-FN具有趨化作用，促進炎癥細胞、成纖維細胞附著和游走，從而達到再生和修復作用[12]。此外，EⅢA-FN作為細胞外基質(zhì)對于肌成纖維細胞的形成具有關鍵性作用。

根據(jù)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果，大鼠骨骼肌生前挫傷后TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達均呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，分別于傷后3d和5d達到峰值，其表達值范圍為11.84～14.03和4.26～6.21，而其他傷后不同時間點TGF-β1和EⅢA-FN mRNA表達值均低于11.84和4.26。因此，如果TGF-β1和EⅢAFN mRNA表達值分別大于11.84和4.26，則可以提示骨骼肌傷后時間為3d和5d。此外，如果不能確定某一指標是否可以區(qū)分生前傷與死后傷，那么該指標的實際應用價值則會降低。因此，本研究不僅觀察了TGF-β1和EⅢA-FN與骨骼肌傷后存活時間的關系，還重點研究了其是否可以鑒別生前傷與死后傷。由于生物學死亡的早期階段組織細胞和器官對刺激尚能產(chǎn)生超生反應，故本研究中死后挫傷組不同時間點均可以檢出TGF-β1和EⅢA-FN mRNA，但是表達值均明顯低于正常未致傷大鼠以及生前挫傷后6 h、10d和14d處死的大鼠，這表明TGF-β1和EⅢA-FN在死后早期骨骼肌超生反應中表達甚微，具有大鼠骨骼肌生前傷與死后傷的鑒別能力。

目前人們對于基因表達通路在人體死亡后發(fā)生的變化知之甚少。POZHITKOV等[13]應用基因芯片分別對死后0～96h斑馬魚和死后0～48h小鼠的腦及肝組織進行1 063個基因的mRNA轉(zhuǎn)錄譜檢測，其中大多是在死后0.5 h內(nèi)增加。FERREIRA等[14]則從基因型-組織表達（genotype-tissue expression，GTEx）項目中獲得36種器官組織的死后數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)：人體骨骼肌大多數(shù)基因在死后早期（小于1 h）表達改變，并且超過600個基因在死后不同時間內(nèi)具有顯著性變化，數(shù)量僅次于橫結(jié)腸。本研究亦觀察到大鼠骨骼肌生前損傷后TGF-β1和EⅢA-FN mRNA分別于死后早期（3 h和6 h）表達即增加。死后樣本中不同種類細胞的存活可能是死后轉(zhuǎn)錄增加的因素之一，如成纖維細胞[15]、嗜酸性粒細胞、單核細胞、中性粒細胞及淋巴細胞[16]在死后短時間內(nèi)不會消失，可以存活56～86 h，小鼠骨骼肌干細胞甚至可以在死亡后14～17 d保持休眠狀態(tài)并保留再生能力[17]。這些存活的細胞會主動和持續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，尤其是參與生存和應激的調(diào)控基因會被激活[13]。為了研究TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的死后表達情況，本研究設定的死后環(huán)境溫度為（25±2）℃、相對濕度為（60±5）%。由于溫度和濕度均為固定值，尚不能完全模擬實際情況。因此，下一步工作將在動態(tài)變化的溫度和濕度環(huán)境中研究傷后骨骼肌基因譜的死后表達。