劉澤明 孫 穎 高玉春 龍懷聰 雷 霆 杜恒健

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，瀘州646000)

急性下呼吸道感染是老年人發(fā)病和致死的重要原因[1]。肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，是一種常見的下呼吸道感染引起的疾病，可由細(xì)菌、病毒、支原體等多種疾病微生物，放射線、吸入性異物等理化因素，免疫損傷，過敏及藥物引起。其中細(xì)菌性肺炎是最常見的肺炎。肺炎是世界范圍內(nèi)傳染病死亡的主要原因之一，死亡率高達(dá)20%～30%[2,3]。開發(fā)有效的肺炎治療方法對(duì)人類醫(yī)療健康事業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道許多天然產(chǎn)物在各類疾病治療中具有積極作用。檸檬苦素類化合物是柑橘類水果如檸檬、橙子、佛手柚等種子、水果和果皮組織中高含氧萜類化合物的次生代謝產(chǎn)物，具有多種藥理學(xué)活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒及殺菌等[4]。檸檬苦素類化合物包括檸檬苦素、葛杜寧、黃柏酮及印楝素等。諾米林(Nomilin)是一種常見的檸檬苦素類化合物，具有抗癌細(xì)胞增殖、抗高血糖及減肥等功效[5,6]。但諾米林在肺炎中的作用還尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。本研究的主要目的是探究諾米林對(duì)克雷伯菌(Klebsiella)老年肺炎大鼠模型炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 50只20～22月齡的SD大鼠購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心?？死撞鷣碓从谥袊镏破窓z驗(yàn)鑒定所，菌株編號(hào)：K46114，用無菌生理鹽水稀釋到2×108ml-1。諾米林(分析純)購自Sigma-Aldrich公司。蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色液和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Solarbio。白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。PE-CD14抗體、抗CD14抗體、抗TLR4抗體、抗NF-κB P65和抗p-P65抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1肺炎模型的建立 首先腹腔注射10%的水合氯醛0.35 ml/100 g麻醉大鼠后將大鼠四肢和牙齒固定于固定臺(tái)上，用止血鉗夾住大鼠的舌，固定于外，經(jīng)上中切牙點(diǎn)懸掛。然后用注射劑鈍圓針頭經(jīng)口插入氣管，滴入克雷伯菌液0.28 ml/kg，此時(shí)感染的大鼠保持原位約10 min，使菌液充分流入肺泡內(nèi)，以達(dá)到肺部感染的目的。對(duì)照組給予等量的生理鹽水。第二天大鼠出現(xiàn)體溫升高，躁動(dòng)或少動(dòng)，撓鼻，打噴嚏，呼吸急促，弓背，站立不穩(wěn)，四肢癱軟，腹肌痙攣，飲食飲水下降等癥狀說明建模成功。

1.2.2動(dòng)物分組及藥物處理 大鼠隨機(jī)分為5組：健康對(duì)照組(Ctrl)、克雷伯菌肺炎模型組、諾米林(10、25、50 mg/kg BW)治療組，每組10只。除對(duì)照組外，其他組大鼠按上述方法接種克雷伯菌進(jìn)行肺炎模型的建立。建模第二天開始給藥，諾米林組腹腔注射10、25、50 mg/kg BW的諾米林，克雷伯菌肺炎模型組和對(duì)照組給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3HE染色觀察病理變化 連續(xù)給藥7 d后用10%的水合氯醛0.35 ml/100 g麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血致死，開胸取肺組織，左肺用4%的多聚甲醛4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50% 和70% 的酒精依次脫水10 min。酒精脫水機(jī)中脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋切片，按照HE染色液說明書進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于20～37℃下孵育15～30 min。PBS漂洗后用3%的H2O2于室溫孵育20 min，再用PBS漂洗3次。然后按照試劑盒說明書進(jìn)行生物素標(biāo)記，顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。最后顯微鏡下觀察拍照，細(xì)胞核呈棕色顆粒的為凋亡細(xì)胞。

1.2.5ELISA檢測炎癥因子水平 肺部組織于含蛋白酶抑制劑的裂解液中冰上勻漿，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行炎癥因子水平檢測。首先樣品加入反應(yīng)孔后37℃孵育45 min，洗滌液洗滌4次。然后加入生物素標(biāo)記的抗體，37℃反應(yīng)30 min，洗滌后加鏈霉親和素-HRP，混勻后37℃反應(yīng)30 min。最后加入顯色劑避光顯色15 min，再加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測吸光值。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測外周血CD14陽性細(xì)胞的比例 收集各組大鼠的外周血，加入紅細(xì)胞裂解液,靜置20 min,300 g離心5 min,去上清,用PBS清洗后制成1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。然后加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體PE-CD14抗體，室溫避光孵育30 min。然后PBS洗滌離心，再用10 g/L的多聚甲醛重懸細(xì)胞，放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，用SSC和PE-CD14為橫、縱的點(diǎn)圖檢測出CD14的陽性細(xì)胞比例。

1.2.7蛋白印跡檢測蛋白水平 肺部組織于含蛋白酶抑制劑的裂解液中冰上勻漿后100℃變性5 min。然后等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間進(jìn)行單因素方差分析后再進(jìn)行Duncan′s multiple ramge test檢驗(yàn)。P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1諾米林可改善克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變 通過HE染色觀察諾米林對(duì)克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變的影響。圖1顯示，對(duì)照組大鼠肺組織中可見形態(tài)不規(guī)則、大小不等的管腔和空泡樣結(jié)構(gòu)，肺泡結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，氣腔擴(kuò)大，呈現(xiàn)輕微的肺氣腫性肺退行性變化。沒有纖毛上皮細(xì)胞壞死脫落、炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變。模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損，肺泡失去含氣狀態(tài)，充滿大量纖維素和紅細(xì)胞，部分肺泡融合，肺實(shí)質(zhì)及支氣管壁大量炎性細(xì)胞浸潤，纖毛上皮壞死、脫落。諾米林(10、25 mg/kg)組大鼠肺部組織可見含氣的空泡腔，氣腔擴(kuò)大，肺泡及管內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞浸潤，但較模型組好轉(zhuǎn)。諾米林(50 mg/kg)組大鼠肺部組織可見含氣的肺泡腔，氣腔擴(kuò)大，氣管黏膜上皮排列整齊，無明顯的炎性細(xì)胞浸潤。上述結(jié)果表明，諾米林可改善克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變。

2.2諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細(xì)胞凋亡 利用TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡，分析諾米林對(duì)克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細(xì)胞凋亡的影響。如圖2所示，模型組大鼠肺部組織細(xì)胞凋亡高于對(duì)照組(P<0.01)。諾米林(10、25、50 mg/kg)組大鼠肺部組織細(xì)胞凋亡低于模型組(P<0.01)。由此可見，諾米林可減弱克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細(xì)胞凋亡。

2.3諾米林可減輕克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織炎癥反應(yīng) 為分析諾米林對(duì)克雷伯菌老年肺炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響，通過ELISA檢測肺部組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平。由圖3可知，模型組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平高于對(duì)照組(P<0.01)。與模型組相比，諾米林(10、25、50 mg/kg)組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平下降(P<0.01)。以上結(jié)果說明，諾米林可減輕克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織炎癥反應(yīng)。

圖1 HE染色觀察肺部組織病變Fig.1 Pathological changes of lung tissues were observed by HE staining

圖2 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by TUNEL stainingNote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

圖3 ELISA檢測炎癥因子水平Fig.3 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

圖5 蛋白印跡檢測TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of TLR4/NF-κB pathway related proteins were detected by Western blotNote：*.P<0.01 vs.control group；#.P<0.01 vs.Klebsiella model group.

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD14陽性細(xì)胞比例Fig.4 CD14 positive cell rate in peripheral blood was tested by flow cytometryNote：*.P<0.01 vs control group；#.P<0.01 vs Klebsiella model group.

2.4諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14陽性細(xì)胞的比例 通過流式細(xì)胞分選技術(shù)分析諾米林對(duì)克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14含量的影響。圖4顯示，模型組大鼠外周血中CD14陽性細(xì)胞數(shù)比例高于對(duì)照組(P<0.01)。與模型組相比，諾米林(10、25、50 mg/kg)組大鼠外周血中CD14陽性細(xì)胞數(shù)比例降低(P<0.01)。上述結(jié)果表明，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14陽性細(xì)胞的比例。

2.5諾米林對(duì)克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織TLR4/NF-κB 炎癥通路的影響 為分析諾米林對(duì)克雷伯菌老年肺炎大鼠TLR4/NF-κB 炎癥通路的影響，蛋白印跡檢測肺部組織CD14、TLR4、NF-κB P65和p-P65的蛋白水平。如圖5所示，模型組大鼠CD14和 TLR4表達(dá)及p-P65/P65蛋白比值高于對(duì)照組(P<0.01)。與模型組相比，諾米林(10、25、50 mg/kg) 組大鼠CD14和 TLR4表達(dá)及p-P65/P65蛋白比值下降(P<0.01)。由此可見，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織CD14和 TLR4表達(dá)及NF-κB P65磷酸化水平，抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化。

3 討論

目前對(duì)細(xì)菌性肺炎患者一般采用抗生素經(jīng)驗(yàn)性治療，如用β-內(nèi)酰胺聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類藥物，呼吸氟喹諾酮類原料藥或四環(huán)素；或者選者一些新的抗菌藥物，如替加環(huán)素和頭孢洛林。然而隨著抗生素的廣泛使用，各種耐藥菌株也不斷增加， 且產(chǎn)生超廣譜酶，這給醫(yī)生在選擇抗生素方面提出了很大挑戰(zhàn)[7]。挖掘肺炎新的有效的治療方法已成為研究熱點(diǎn)。越來越多的研究表明植物提取物在各種疾病治療中發(fā)揮著積極作用。

大量文獻(xiàn)報(bào)道植物提取物具有改善各種疾病中組織病變的功效。有數(shù)據(jù)顯示草木犀提取物可改善盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)誘導(dǎo)的肺損傷大鼠水腫及炎性細(xì)胞浸潤等病理變化[8]。Sohn等[9]發(fā)現(xiàn)香芋提取物可減輕H1N1病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部組織炎性細(xì)胞浸潤及杯狀細(xì)胞增生等病變。有研究顯示檸檬苦素可緩解D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝臟組織門靜脈單核細(xì)胞浸潤、組織水腫、纖維化等病理變化[10]。據(jù)報(bào)道黃柏酮可改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織纖維化及炎性細(xì)胞浸潤等病變[11]。本研究利用老年大鼠克雷伯菌肺炎模型，發(fā)現(xiàn)諾米林可減輕肺泡破壞、炎癥細(xì)胞浸潤、纖毛上皮壞死脫落，從而改善肺炎病理改變。

肺炎過程中常常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的增加[12]。越來越多的數(shù)據(jù)表明植物提取物可逆轉(zhuǎn)各類疾病中異常的細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)非洲桃花心木的檸檬苦素類化合物可抑制對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)的作用[13]。據(jù)報(bào)道兒茶的樹皮提取物可減弱苯并芘誘導(dǎo)的肺毒性小鼠Bax和Caspase-3表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[14]。有數(shù)據(jù)顯示在缺血再灌注大鼠中，檸檬苦素可降低Caspase-3的活性[15]。本文結(jié)果表明，諾米林可減弱克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織細(xì)胞凋亡。

炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)是各類疾病的常見特征，大量研究表明許多植物提取物具有抗炎功效。Ahmad等[16]發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素提取物可抑制卡拉膠誘導(dǎo)的小鼠肺部組織ICAM-1、IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的表達(dá)。據(jù)報(bào)道在香煙煙霧冷凝物聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥模型中，蛇床子提取物可降低TNF-α、IL-6和MIP-2的水平[17]。有數(shù)據(jù)顯示葛杜寧減弱酵母聚糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠TNF-α、IL-6和PGE2表達(dá)[18]。有研究表明印楝素可降低角叉菜膠誘導(dǎo)的足腫脹小鼠TNF-α的表達(dá)[19]。據(jù)報(bào)道諾米林可減弱TNF-α誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞IL-1β、IL-4和 IL-6的釋放[20]。Pratheeshkumar等[21]發(fā)現(xiàn)諾米林可抑制黑色素瘤荷瘤小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌。本研究結(jié)果顯示，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α水平，緩解炎癥反應(yīng)。

TLR-4/NF-κB通路在各類疾病的炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用[22]。有研究表明LPS可激活急性肺損傷小鼠中肺臟的氣道上皮和肺泡隔膜細(xì)胞TLR-4通路，肺臟中的巨噬細(xì)胞會(huì)分泌各種炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的增強(qiáng),越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道植物提取物可調(diào)節(jié)TLR-4/NF-κB通路[23,24]。有研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮可減弱脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞CD14和TLR4的表達(dá)[25]。黃杞苷可降低脂多糖誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎小鼠TLR4和細(xì)胞核內(nèi)NF-κB P65水平，抑制NF-κB通路活化[26]。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)黃芪提取物可抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的支氣管哮喘小鼠NF-κB通路活化。據(jù)報(bào)道葛杜寧可通過TLR-4介導(dǎo)的信號(hào)通路降低脂多糖誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)[28]。本文結(jié)果顯示，諾米林可降低克雷伯菌老年肺炎大鼠外周血中CD14含量，減弱肺部組織CD14和 TLR4表達(dá)及NF-κB P65磷酸化水平，抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化。

綜上所述，在克雷伯菌老年肺炎大鼠模型中，諾米林可改善肺部組織病變，減弱細(xì)胞凋亡，抑制IL-6,IL-1β和TNF-α水平，降低外周血中CD14含量，減弱肺部組織CD14和 TLR4表達(dá)及NF-κB P65磷酸化水平。諾米林還可通過抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化緩解克雷伯菌老年肺炎大鼠肺部組織病變、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。下一步將研究諾米林對(duì)其他類型的肺炎如病毒性肺炎的影響，為肺炎的治療提供參考。