張延梅 嚴(yán)瑞明 丁玫琳 鄭 華 蔣小滔 吳 砂

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣州510515)

自身免疫性糖尿病是一種以自身反應(yīng)性CD4+、CD8+T細胞殺傷自身胰島β細胞為病理特征的自身免疫病[1]，作為抗原提呈細胞，樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)主要通過多種天然受體識別自身成分，在多種因素的影響下，轉(zhuǎn)化為自身反應(yīng)性炎癥性DC，誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細胞形成[2]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)作為樹突狀細胞表面重要識別分子，識別多種病原體及變異自身成分，而TLR2作為 Ⅰ 型跨膜糖蛋白，由N端配體識別域、單跨膜螺和C端細胞質(zhì)信號域三部分組成，配體識別區(qū)可與多種損傷相關(guān)分子模式(Damage associated molecular patterns，DAMP)結(jié)合,并啟動對自身抗原的免疫應(yīng)答[3]。研究顯示TLR2參與了對損傷自身胰島β細胞的自身識別，因此促進自身免疫性糖尿病的持續(xù)性自身免疫應(yīng)答[4]。然而也有研究表明，TLR2可增強CD4+CD25+Treg的功能,抑制機體的免疫應(yīng)答，認(rèn)為TLR2的激活對自身免疫性糖尿病是一種保護作用[5，6]。因此，關(guān)于TLR2對自身免疫性糖尿病的作用仍有爭論。非肥胖型糖尿病(No obesity diabetes，NOD)小鼠在遺傳易感基因背景下，其自身免疫反應(yīng)引起分泌胰島素的B細胞損傷，6周齡時發(fā)生胰島炎，最終導(dǎo)致自身免疫性糖尿病[7]。因此本研究利用NOD小鼠動物模型，分別利用TLR2阻斷性抗體及多肽對DC進行阻斷，觀察阻斷效果對自身免疫性糖尿病的影響，從而針對TLR2通路對自身免疫性糖尿病的影響機制進行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 NOD小鼠由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院王從義教授饋贈，小鼠均為4～6周齡雌性小鼠，飼養(yǎng)流程嚴(yán)格按照南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心操作規(guī)程進行。

1.1.2試劑 RPMI1640、胎牛血清和胰酶均購自美國Gibco公司，ELISA試劑盒購自Ebioscience公司，CD11c、CD80、CD86、I-Ek、CD8、CD107a、IFN-γ流式抗體、固定劑、轉(zhuǎn)錄因子固定液和破膜液均購自Ebioscience公司，p-STAT1和p-STAT3檢測抗體購自CST公司，TLR2阻斷抗體T2.5購自Biolegend公司，GM-CSF和IL-4購自Peprotech公司。TLR2阻斷多肽為前期工作根據(jù)小鼠TLR2 胞外段編碼氨基酸為模板、由深圳強耀公司合成。胰島β細胞NIT-1由本室保存。

1.2方法

1.2.1小鼠DC的制備 斷頸處死4周小鼠，無菌取其脛腓骨，RPMI1640沖洗獲得骨髓，用含10 ng/ml GM-CSF和5 ng/ml IL-4的10%1640培養(yǎng)7 d，收取細胞后流式細胞儀檢測CD11c，檢測純度為90%。

1.2.2TLR2阻斷方案 TLR2阻斷抗體體外作用濃度為10 μg/ml,多肽作用濃度為10 μg/ml。阻斷TLR2后的DC通過尾靜脈方式以2×106個細胞注入小鼠體內(nèi)。

1.2.3NOD小鼠血糖的檢測 采取斷尾取血法，從小鼠2周齡起每4 d測血糖1次。血糖濃度連續(xù)2 d >14 mmol/L診斷為糖尿病。

1.2.4ELISA檢測小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6 眼球取血法收集糖尿病和正常NOD小鼠的外周血約0.6 ml，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清中的TNF-α和IL-6的含量。

1.2.5流式檢測細胞表面分子 取各組小鼠的脾臟，制備單細胞懸液，取2×106個脾細胞，100 μl PBS重懸，加入1×106個胰島β細胞，混勻，37℃共孵育6 h。先加CD8抗體染色4℃孵育30 min后洗滌一次，加入CD107a抗體 37℃孵育30 min，500 μl PBS重懸，加入7-AAD，混勻，流式細胞儀檢測。對于DC細胞表面分子CD11c、CD80、CD86和I-Ek進行染色均在4℃孵育30 min,FlowJo V10分析數(shù)據(jù)和制圖。

1.2.6流式檢測胞內(nèi)細胞因子 取2×106個脾細胞，500 μl 1640培養(yǎng)基重懸，加入3 μl高爾基體阻斷劑，加入1×106個胰島β細胞，混勻，37℃共孵育6 h。按如上方法染細胞表面分子CD8，PBS洗完棄上清后，加入100 μl固定液，室溫固定30 min，2 ml破膜液洗滌。加入細胞因子IFN-γ的流式抗體，4℃染色30 min，洗滌后PBS混勻，流式細胞儀檢測。

1.2.7流式檢測胞內(nèi)細胞因子 取2×106個脾細胞，加入100 μl轉(zhuǎn)錄因子固定液，室溫固定30 min，2 ml破膜液洗滌。分別加入轉(zhuǎn)錄因子p-STAT1和p-STAT3的流式抗體，4℃染色30 min，洗滌后PBS重懸，混勻，流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0及GraphPad Prism5.01分析數(shù)據(jù)和制圖，對照組和實驗組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TLR2阻斷抑制糖尿病小鼠的DC細胞成熟 經(jīng)過TLR2體外阻斷作用后，DC表面多種活化分子表達明顯降低。共刺激分子CD86、CD80表達明顯降低，MHCⅡ類分子I-Ek表達下降(P<0.05)，見圖1。共刺激分子及活化分子下降，表明經(jīng)過TLR2阻斷后，DC活化相關(guān)分子及共刺激分子下降，影響DC的抗原提呈功能。

圖1 TLR2阻斷抑制DC細胞成熟Fig.1 TLR2 blockade inhibits maturation of DC cell

2.2TLR2阻斷對p-STAT1與p-STAT3的影響 STAT3與STAT1信號通路是影響DC分化的重要通路分子。STAT1通路活化誘導(dǎo)了自身反應(yīng)性DC，而STAT3通路更容易誘導(dǎo)免疫抑制型DC(P<0.05)。TLR2阻斷后，抑制STAT1的磷酸化，而增強了STAT3的磷酸化(圖2)。

2.3TLR2阻斷抑制糖尿病小鼠脾臟CD8+T細胞應(yīng)答 經(jīng)過TLR2阻斷后，小鼠脾臟CD8+T細胞胞內(nèi)IFN-γ明顯減弱，表明其活化受到抑制。脫顆粒作為殺傷性T細胞的重要殺傷機制，CD107a表達是其關(guān)鍵分子。經(jīng)過TLR2阻斷后，CD8+T細胞的CD107a表達明顯下降(圖3)，證實其殺傷能力減弱。

圖2 TLR2阻斷對p-STAT3與p-STAT1的影響Fig.2 Effect of TLR2 blockade on p-STAT1 and p-STAT3

圖3 TLR2阻斷抑制糖尿病小鼠脾臟CD8+T細胞活化與脫顆粒Fig.3 TLR2 blockade inhibits activation and degranul-ation of splenic CD8+T cell in diabetic mice

2.4TLR2阻斷抑制炎癥因子產(chǎn)生 炎癥因子的大量產(chǎn)生是導(dǎo)致自身免疫性糖尿病的重要影響因素，TNF-α、IL-6通過多種機制促進殺傷性T細胞的活化，參與了胰島細胞自身免疫損傷的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)過TLR2阻斷后，炎癥因子TNF-α、IL-6水平均明顯下降(圖4)，證實TLR2阻斷影響了炎癥環(huán)境的形成。

2.5TLR2阻斷抑制糖尿病發(fā)生 血糖升高是自身免疫性糖尿病的典型癥狀，通過連續(xù)監(jiān)測血糖升高，直到血糖達到14 mmol/L確診為糖尿病。通過TLR2阻斷后，NOD小鼠血糖升高明顯減慢，糖尿病發(fā)病時間明顯推遲，見圖5。

圖4 TLR2阻斷抑制炎癥因子產(chǎn)生Fig.4 TLR2 blockade inhibits inflammatory cytoki-nes productionNote: Error bars represent the of three independent experiments.*.P<0.05，***.P<0.001.

圖5 TLR2阻斷抑制糖尿病發(fā)生Fig.5 TLR2 blockade inhibits pathogenesis of diabetesNote: Error bars represent the of three independent experiments.**.P<0.01，***.P<0.001.

3 討論

TLRs通常被認(rèn)為是“損傷敏感”分子，可識別并結(jié)合多種DAMP，包括細胞死亡后釋放的各種物質(zhì)(HMGB1、HSP等)[8，9]。TLR2結(jié)合配體后會激活下游的MyD88-IRAKs-TRAF6通路，從而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB導(dǎo)致促炎性因子(IL-6、IFN-α等)的產(chǎn)生[10]。自身免疫性糖尿病患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)處于高度激活的狀態(tài)，外周血含有大量自身反應(yīng)性T細胞[11]。研究顯示在NOD小鼠體內(nèi)，凋亡胰島β細胞的產(chǎn)物激發(fā)的TLR2信號通路會激活抗原提呈細胞并誘發(fā)針對β細胞的特異性免疫應(yīng)答[4]。凋亡胰島β細胞中含有多種自身抗原肽，包括胰島素、GAD15、IA-2和ZnT8等[12]，CD8+T細胞能夠識別3周齡NOD小鼠胰腺上的胰島素抗原表位(B：15-23)，這群CD8+T細胞隨著小鼠年齡增大迅速減少，然后出現(xiàn)大量識別其他特異性自身抗原肽的CD8+T細胞[13]，可通過分泌IFN-γ、穿孔素及Fas-FasL等促進胰島B細胞的死亡[11]，從而導(dǎo)致糖尿病。所以，TLR2能夠促進糖尿病的進展。

本研究發(fā)現(xiàn)TLR2阻斷使STAT1的磷酸化下調(diào)，STAT3的磷酸化上調(diào)。STAT通路是一類可介導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)控DC的發(fā)展和激活[14]，有研究顯示STAT3負(fù)向調(diào)控DC的免疫應(yīng)答，抑制Jak2/STAT3通路會促進小鼠DC的分化和激活[15]，STAT3的激活會分泌抗炎因子IL-10，從而抑制DC的成熟，導(dǎo)致T細胞耐受[16]，STAT1的激活會上調(diào)促炎性基因表達，增強DC對炎癥的免疫應(yīng)答[17]，同時發(fā)現(xiàn)STAT3的激活會抑制STAT1。DC的TLR2在識別配體后激活NF-κB通路，促進細胞因子(如TNF、IL-12)的釋放，而這些細胞因子在與其受體結(jié)合后激活STAT1通路[18]。所以TLR2阻斷可能抑制了STAT1通路，激活了STAT3通路。

有研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性糖尿病的發(fā)病率與感染性疾病成負(fù)相關(guān)，TLR2可識別多種病原體及其產(chǎn)物，如肽聚糖、脂多糖等，而這些TLR2的配體均有相似的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如NF-κB通路)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[19，20]。然而研究顯示DC表面的TLR2可與酵母聚糖(活性成分為葡聚糖)結(jié)合，導(dǎo)致大量的IL-10、TNF-α釋放，而IL-10、TNF-α等可增強Treg的功能從而抑制病理性T細胞應(yīng)答[21，22]，這暗示著酵母聚糖會抑制自身免疫性糖尿病的自身免疫反應(yīng)。本次研究中所使用的TLR2阻斷多肽模擬TLR2的胞外段蛋白，阻斷TLR2對凋亡胰島β細胞的識別。多肽的阻斷作用雖然不如抗體及多種抑制劑，但由于其制備容易，不容易引發(fā)過敏反應(yīng)，具有一定的優(yōu)勢。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)TLR2阻斷抑制自身免疫性糖尿病小鼠DC的活化，從而抑制糖尿病小鼠自身反應(yīng)性殺傷性CD8細胞的活化，抑制小鼠胰島細胞受到自身免疫性損傷，從而抑制自身免疫性糖尿病，表明DC的TLR2阻斷可以抑制自身免疫性糖尿病的發(fā)生發(fā)展，為后續(xù)相關(guān)研究及治療提供了新的研究策略。