岳元?jiǎng)?，?影，任志忠，黃 鑫，楊曉偉，張躍偉*

(1.大連大學(xué)中山臨床學(xué)院，遼寧 大連 116001；2.清華大學(xué)附屬北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院肝膽介入科，北京 102218)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第六大流行癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因[1]。多數(shù)HCC患者確診時(shí)已失去手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。目前TACE已成為治療HCC的重要方法[2]。近年來，髓系來源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)因其在促血管生成、炎癥發(fā)生和腫瘤進(jìn)展、腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中發(fā)揮的作用而逐漸受到關(guān)注[3]。國(guó)外學(xué)者[4]報(bào)道，經(jīng)肝動(dòng)脈化療灌注術(shù)(hepatic arterial infusion chemotherapy, HAIC)治療后，HCC患者外周血中MDSCs頻率(即MDSCs細(xì)胞團(tuán)占HLA-DR-細(xì)胞群的比例)下降，但目前鮮見關(guān)于TACE治療對(duì)HCC患者外周血中MDSCs影響的研究報(bào)道。本研究對(duì)5例Barcelona臨床腫瘤(Barcelona clinic liver cancer, BCLC)分期B期HCC患者行明膠海綿微粒(gelatin sponge microparticles, GSMs)TACE(GSMs-TACE)，觀察治療前后不同時(shí)間點(diǎn)外周血中MDSCs變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月—2017年4月我院收治的5例BCLC B期HCC患者(HCC組)。根據(jù)慢性肝炎狀態(tài)、影像學(xué)檢查結(jié)果和腫瘤標(biāo)志物升高診斷HCC，所有患者均存在多個(gè)肝內(nèi)病灶(即經(jīng)增強(qiáng)CT或增強(qiáng)MR檢查確認(rèn)左側(cè)和/或右側(cè)葉中有≥3個(gè)病灶)，且均為初診患者，GSMs-TACE術(shù)前均未接受其他治療，患者年齡、性別、肝功能Child-Pugh分級(jí)、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen， HBsAg)檢測(cè)結(jié)果及病灶最大徑見表1。同期征集7名健康志愿者作為正常對(duì)照組，男5名，女2名，年齡38～50歲，平均(44.7±4.5)歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批注，受試者均知情同意。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)化GSMs-TACE 采用Siemens Artis Zee DSA機(jī)引導(dǎo)介入治療。以Seldinger法穿刺右側(cè)股動(dòng)脈后，采用5F-RH肝管行腹腔動(dòng)脈、肝總動(dòng)脈造影，依據(jù)腫瘤部位、大小及腫瘤染色是否完整等情況，選擇性進(jìn)行膈動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈、胃左動(dòng)脈、右腎動(dòng)脈、胸廓內(nèi)動(dòng)脈、肋間動(dòng)脈等造影，以明確腫瘤血供(圖1A)。根據(jù)腫瘤大小確定洛鉑用量(腫瘤最大徑<5 cm,劑量10 mg；最大徑5～10 cm,劑量20 mg；最大徑>10 cm，劑量30 mg)[5]，以注射用水稀釋至30 ml后，與直徑350～560 μm的GSMs(杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司)混合成為懸浮液。于腫瘤區(qū)域供血?jiǎng)用}內(nèi)，將GSMs與化療藥物的混懸液通過導(dǎo)管緩慢注射，栓塞停止標(biāo)準(zhǔn)為造影顯示腫瘤染色完全消失(圖1B)、腫瘤區(qū)域動(dòng)脈內(nèi)血流停滯。

圖1 患者男，44歲，因原發(fā)性HCC接受GSMs-TACE A.術(shù)中肝動(dòng)脈造影可見大片腫瘤染色； B.將GSMs與化療藥物充分混合后栓塞腫瘤供血?jiǎng)用}，再次造影顯示腫瘤染色消失； C.術(shù)后30天上腹部增強(qiáng)MRI示原腫瘤區(qū)域強(qiáng)化消失

表1 HCC患者臨床資料

術(shù)后4～7天常規(guī)予以護(hù)肝、補(bǔ)液、抑酸等治療。術(shù)后30天復(fù)查增強(qiáng)MRI，參照改良實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(modified response evaluation criteria in solid tumors， m-RECIST)評(píng)價(jià)療效[6]：完全緩解(complete response， CR)，所有目標(biāo)病灶動(dòng)脈期增強(qiáng)顯影均消失；部分緩解(partial response， PR)，目標(biāo)病灶(動(dòng)脈期增強(qiáng)顯影)最大徑之和縮小≥30%；病變進(jìn)展(progressive disease， PD)，目標(biāo)病灶(動(dòng)脈期增強(qiáng)顯影)最大徑之和增加≥20%或出現(xiàn)新的病灶；穩(wěn)定(stable disease， SD)，目標(biāo)病灶(動(dòng)脈期增強(qiáng)顯影)最大徑之和縮小未達(dá)PR或增加未達(dá)PD。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 對(duì)HCC組患者分別于GSMs-TACE術(shù)前、術(shù)后10天及術(shù)后30天采集空腹外周靜脈血4 ml置于肝素抗凝管中，用于MDSCs檢測(cè)及血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、異常凝血酶原(protein-Ⅱ induced by vitamin Kabsence， PIVKA-Ⅱ)檢查；對(duì)正常對(duì)照組于HCC患者GSMs-TACE術(shù)前同期采血，僅用于MDSCs檢測(cè)。

MDSCs檢測(cè)方法：將100 μl全血加入干燥的空白管中，以500 μl OptiLyse C溶解液(Beckman Coulter公司)裂解血液并渦旋混勻，將裂解的血液于室溫下孵育15 min，以確保裂解完成；而后加入2 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer， PBS)，渦旋混勻后，以300 r/min離心5 min。吸出上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于500 μl PBS中，并向其中分別加入CD14-PC7(Beckman Coulter公司)、CD11b-APC-Alexa Fluor 750(Beckman Coulter公司)和 Anti-HLA-DR-ECD(Beckman Coulter公司)單克隆抗體各5 μl，低速混合5 s后，用于樣品分析。采用Beckman Coulter DxFLEX流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞收集和分選，通過Beckman Coulter CytExpert 1.1系統(tǒng)分析確定MDSCs頻率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。方差齊性檢驗(yàn)顯示方差不齊,故采用秩和檢驗(yàn)比較HCC患者GSMs-TACE術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間MDSCs頻率的差異，兩兩比較采用LSD法。以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較HCC組GSMs-TACE術(shù)前與正常對(duì)照組同期MDSCs頻率的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HCC組5例患者GSMs-TACE術(shù)后30天療效評(píng)價(jià)結(jié)果均為PR(圖1C)。

MDSCs檢測(cè)結(jié)果見表2。HCC患者GSMs-TACE術(shù)前、術(shù)后10天及術(shù)后30天平均MDSCs頻率分別為(30.26±12.12)%、(10.22±3.79)%及(7.33±3.38)%，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且呈逐漸下降趨勢(shì)；兩兩比較結(jié)果顯示：術(shù)后30天與術(shù)后10天比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.189)，但術(shù)后10天、30天均明顯低于術(shù)前(P<0.001、0.011)。GSMs-TACE術(shù)前，HCC組MDSCs頻率明顯高于正常對(duì)照組同期水平[(30.26±12.12)% vs (3.41±1.89)%，t=5.876,P<0.001；圖2、3)。

圖2 患者女，28歲，原發(fā)性HCC，GSMs-TACE術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間流式細(xì)胞圖 A.術(shù)前MDSCs頻率為35.12%； B.術(shù)后10天MDSCs頻率為12.37%； C.術(shù)后30天MDSCs頻率為11.62% 圖3 健康志愿者，男，46歲 流式細(xì)胞圖，MDSCs頻率為3.04%

HCC組GSMs-TACE術(shù)前、術(shù)后10天及術(shù)后30天血清AFP、PIVKA-Ⅱ見表3，亦表現(xiàn)出與MDSCs頻率相同的下降趨勢(shì)。

表2 2組不同受試者GSMs-TACE術(shù)前及術(shù)后10天、30天的MDSCs頻率(%)

3 討論

目前雖然不能清晰地定義總的MDSCs，但依據(jù)表面標(biāo)記不同，可將MDSCs細(xì)分為多形核細(xì)胞來源髓系抑制性細(xì)胞(polymorphonuclear-MDSCs， PMN-MDSCs)CD11b+/CD14-/CD15+或CD66+亞群，單核細(xì)胞來源髓系抑制性細(xì)胞(monocytic-MDSCs， M-MDSCs)CD11b+/CD14+/HLA-DR-Low/-亞群及早期髓系抑制性細(xì)胞(early-stage MDSCs， e-MDSC)Lin-(CD3/14/15/19/56)/HLA-DR-/CD33+亞群[7]。本研究檢測(cè)的MDSC為M-MDSCs。

TACE已成為臨床治療中晚期肝癌的主要方法之一。美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)(American Association for the Study of Liver Diseases， AASLD)指南[8]推薦，對(duì)腫瘤過大或因多發(fā)病灶而無法切除且無血管浸潤(rùn)或肝外播散的中晚期肝癌患者,可將TACE作為一線非根治性治療手段，以提高患者生存率；在BCLC分期中，B期患者推薦進(jìn)行TACE治療。本課題組前期研究[9]也證實(shí)GSMs-TACE治療BCLC B期HCC具有較好的安全性，且術(shù)后隨訪6個(gè)月患者生存率為100%，1年生存率為87.5%，中位生存時(shí)間為25個(gè)月，表明該方法可使HCC患者獲益。此外，晚期HCC患者T淋巴細(xì)胞亞群和紅細(xì)胞免疫功能下降，將免疫治療與TACE相結(jié)合有利于提高療效[10]。但一些免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞,如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)與MDSCs過多會(huì)影響免疫治療的療效。Wang等[11]認(rèn)為Treg和MDSCs可限制嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(chimeric antigen receptor T cell immunotherapy， CAR-T)細(xì)胞的敏感性。

MDSCs是骨髓中的一組未成熟細(xì)胞，其在惡性腫瘤、感染或創(chuàng)傷等病理?xiàng)l件下擴(kuò)增，并失去分化為成熟巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞或粒細(xì)胞的能力[12]。MDSCs能夠強(qiáng)烈抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，同時(shí)激活Treg擴(kuò)增，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。Hoechst等[13]研究發(fā)現(xiàn)CD14-/HLA-DR-low/-MDSCs在HCC患者外周血與腫瘤微環(huán)境中均顯著增多，并抑制T細(xì)胞功能。本研究結(jié)果也顯示HCC組外周血中MDSCs頻率明顯高于正常對(duì)照組。腫瘤發(fā)生及發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，多學(xué)科綜合治療是臨床廣泛采用的治療模式。不同的局部治療手段與全身免疫治療聯(lián)合的優(yōu)化治療模式是目前的研究熱點(diǎn)之一，但優(yōu)化組合和最佳治療時(shí)機(jī)是取得良好療效的關(guān)鍵。本研究表明GSMs-TACE治療可有效降低腫瘤負(fù)荷，術(shù)后30天5例HCC患者均達(dá)到PR，并可顯著降低外周血中MDSCs頻率，術(shù)后10天及30天均明顯低于術(shù)前(P均<0.05)；理論上，該方法聯(lián)合免疫治療(如PD-1或PD-L1免疫治療)可獲得更好的療效。此外，Weber等[14]研究發(fā)現(xiàn)在活化的MDSCs中PD-L1配體呈高表達(dá)，其與T細(xì)胞表面的PD-1受體相互作用并最終使得T細(xì)胞喪失抗腫瘤的能力。未來PD-L1+MDSC有望成為肝癌免疫治療的新靶點(diǎn)。

表3 HCC患者GSMs-TACE術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間血清AFP及PIVKA-Ⅱ水平

本研究初步分析GSMs-TACE對(duì)HCC患者外周血中MDSCs的影響，發(fā)現(xiàn)與術(shù)前相比，術(shù)后MDSCs頻率逐漸下降，表明GSMs-TACE對(duì)HCC患者的免疫狀態(tài)具有正向調(diào)節(jié)作用，可為GSMs-TACE聯(lián)合各種免疫治療方法的選擇提供理論依據(jù)。今后將擴(kuò)大樣本量并長(zhǎng)期隨訪，觀察MDSCs頻率是否與GSMs-TACE療效和HCC患者生存時(shí)間存在相關(guān)性，為進(jìn)一步臨床研究奠定基礎(chǔ)。