鄧新武 黃金光 張永強(qiáng) 鄧 璨 歐陽名洋 周可人

（湖南省郴州市宜章縣第一中學(xué) 湖南郴州 424200）

藤茶， 學(xué)名為顯齒蛇葡萄（Ampelopisis grossedentata），是一種典型的類茶植物，俗稱莓茶、山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴等，主要分布于廣西、廣東、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等省區(qū)［1－2］。 近年來，國內(nèi)外對藤茶的研究，主要集中在藤茶中黃酮類、 蛇葡萄素和二氫楊梅素等有效成分的分離和提取，以及藤茶在抗氧化、降血壓和調(diào)節(jié)免疫等方面的功效［3］。

有研究表明藤茶中的二氫楊梅素對大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用［4］。 藤茶對酵母菌、毛霉、青霉、曲霉等真菌是否也有抑制作用？目前并沒有相關(guān)文獻(xiàn)研究報(bào)道。本研究主要探究藤茶對酵母菌、毛霉、青霉和黑曲霉等真菌的抑制作用，具有一定的創(chuàng)新性和實(shí)用性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 饅頭、牛奶、藤茶、發(fā)霉的橘子皮、發(fā)霉的面包等。

1.2 試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)試劑包括馬鈴薯－肉湯培養(yǎng)基（PDA）、察氏培養(yǎng)基、瓊脂、納他霉素、酒精和蒸餾水；實(shí)驗(yàn)儀器包括高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱、恒溫生化培養(yǎng)箱、搖床培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電子天平、數(shù)碼光學(xué)顯微鏡、超聲波細(xì)胞破碎儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物的培養(yǎng)、純化及初步鑒定 無菌條件下，分別從發(fā)霉的橘子皮、發(fā)霉的面包中挑取菌落接種至EP 管， 將EP 管置于振蕩器上振蕩，制成菌懸液。 將稀釋后的菌懸液涂布至PDA 培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d。 長出單菌落后，肉眼觀察菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面的特征。挑取單菌落于顯微鏡下觀察霉菌形態(tài)特征，包括菌絲結(jié)構(gòu)、孢子特點(diǎn)、孢子囊的形態(tài)，進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2 不同提取方法及不同濃度的藤茶浸出液抑菌作用研究 按照表1 的方法制備藤茶常溫?zé)o菌水提取物A、藤茶沸水提取物B、藤茶酒精提取物C、D 和E， 藤茶酒精提取物C、D 和E 的質(zhì)量濃度分別為0.05 g／mL、0.1 g／mL 和0.15 g／mL。以上幾種溶液使用前均進(jìn)行過濾除菌處理。

表1 不同提取方法及其不同濃度的藤茶溶液

將分離純化的酵母菌、青霉、毛霉和黑曲霉菌種活化后， 用無菌水稀釋成含菌數(shù)約為108個(gè)/mL的菌懸液， 再用微量移液器吸取100 μL 菌懸液均勻涂布至PDA 固體平板。 用直徑為7 mm 的無菌打孔器在每個(gè)PDA 平板十字形對稱打4 個(gè)孔，按圖1 所示，每一菌種每孔滴加藤茶提取物100 μL，28℃恒溫箱培養(yǎng)3 d，測定抑菌圈的大小，每個(gè)菌種做5 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。 抑菌圈大小=抑菌圈直徑－酒精的空白對照的抑菌圈直徑－打孔器直徑。

圖1 PDA 平板打孔示意圖（字母代表提取物類型）

1.3.3 食品防腐實(shí)驗(yàn)

1）分別量取150 mL 盒裝純牛奶倒入2 個(gè)燒杯中，用量筒量取25 mL 藤茶溶液倒入其中一個(gè)燒杯中，攪拌均勻，另一個(gè)燒杯加25 mL 蒸餾水作為對照組，將2 個(gè)燒杯置于昏暗室內(nèi)。

2）取新鮮饅頭掰成大小大致相等的兩塊，將其中一塊完全浸入藤茶溶液中， 另一塊浸入等量的蒸餾水中，處理10～15 s 秒后取出，將2 塊饅頭分別放在經(jīng)高溫殺毒后的2 個(gè)餐盤中， 置于昏暗的房間角落。 每天18∶30 觀察牛奶及饅頭腐敗情況、有無異味，并記錄結(jié)果。

圖2 酵母菌顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖3 酵母菌PDA 平板菌落

圖4 青霉菌顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖5 青霉菌查氏平板菌落

圖6 黑曲霉顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖7 黑曲霉查氏平板菌落

圖8 毛霉菌顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖9 毛霉菌PDA 平板菌落

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的初步鑒定 通過觀察菌落特征及顯微鏡下觀察（圖2～圖9），分離出酵母菌、青霉菌、黑曲霉和毛霉。

2.2 抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 藤茶浸出液不同提取方法抑菌作用研究3 種不同提取方法的抑菌結(jié)果如表2 所示。 表中所列數(shù)據(jù)為5 個(gè)重復(fù)平板抑菌圈直徑的平均值（剔除了個(gè)別相差較大的數(shù)據(jù)）。

表2 不同提取方法的提取液對實(shí)驗(yàn)菌種的抑制作用

由表2 數(shù)據(jù)分析可知，3 種提取方法中，滅菌的常溫蒸餾水（提取物A）不具有抑菌的作用，75%酒精（提取物C）效果最佳，沸水次之。沸水提取效果較差，可能與高溫破壞相應(yīng)物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，需進(jìn)一步探究。

2.2.2 不同濃度的藤茶提取物抑菌作用研究由表3 數(shù)據(jù)分析可知， 不同濃度的藤茶浸出液對4 種實(shí)驗(yàn)菌種都有抑制作用， 其中對毛霉的抑制作用較弱，而對酵母菌的抑制作用較強(qiáng)。不同濃度的藤茶浸出液對同一菌種的抑制作用相差不大。典型的抑菌圈結(jié)果見圖10。

表3 不同濃度的藤茶提取液對試驗(yàn)菌種的抑制作用

圖10 酵母菌抑菌結(jié)果

2.3 食品防腐實(shí)驗(yàn) 食品防腐實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)的時(shí)間為2017年12月初，日平均溫度約14℃， 所以普通的饅頭和牛奶都不易變質(zhì)；而添加了藤茶溶液的饅頭、牛奶更不容易變質(zhì)，說明藤茶溶液確實(shí)具有一定的防腐抑菌作用。

表4 藤茶浸出液對食品防腐的結(jié)果

3 討論與展望

本實(shí)驗(yàn)以白酵母、青霉、毛霉和黑曲霉作為實(shí)驗(yàn)菌種， 探究了藤茶浸出液對這些菌種的抑制作用。 由于各平板中真菌生長速度不同，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)很不均一，有些平板數(shù)據(jù)差別較大，可能與滴加的藤茶溶液有關(guān)，也可能是滴加菌液后，涂布平板不均勻?qū)е碌?。多次重?fù)的結(jié)果都表明藤茶浸出液對酵母菌有較強(qiáng)的抑制作用， 而對毛霉抑制作用較弱，對青霉和黑曲霉也有一定的抑制作用。

藤茶能抑制酵母菌、青霉菌、毛霉和黑曲霉等微生物的生長，可以作為防腐劑開發(fā)利用，具有一定的潛在價(jià)值。 本研究小組計(jì)劃下一階段采用乙酸乙酯或超聲波細(xì)胞破碎儀提取藤茶中的有效成分，進(jìn)一步地分離提純，分析究竟是哪些物質(zhì)或物質(zhì)組合具有抑菌作用。 藤茶為天然植物（中藥），是生物源防腐劑， 既可達(dá)到抑菌的效果又不會(huì)對人體產(chǎn)生不利影響，可廣泛用于食品添加劑、衣物防腐劑等。