張新科，司小萌，張朔

（南陽市中心醫(yī)院 麻醉科，河南 南陽 473000）

乳腺癌嚴(yán)重威脅婦女身體健康，為臨床常見婦科腫瘤。調(diào)查顯示近年來其發(fā)病率逐年升高，在所有婦科惡性腫瘤中占據(jù)首位，因此，探究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制對(duì)疾病的靶向治療至關(guān)重要[1]。臨床治療乳腺癌主要以手術(shù)結(jié)合鉑類化療為主，卡鉑為二代鉑類藥物，在乳腺癌治療中應(yīng)用較廣，但容易產(chǎn)生耐藥性，患者生存率并未得到明顯改善，因此，如何降低藥物的耐藥性是目前治療乳腺癌的重要途徑[2]。丙泊酚為臨床常用靜脈麻醉藥物，在乳腺癌等多種腫瘤切除手術(shù)中應(yīng)用廣泛，近期研究顯示其能夠抑制卵巢癌、肝癌、前列腺癌等癌細(xì)胞的侵襲、遷移進(jìn)而抑制腫瘤的增殖[3]。王萍等[4]研究顯示，丙泊酚對(duì)耐藥性癌細(xì)胞具有抑制作用，同時(shí)不作用于敏感腫瘤細(xì)胞，與化療藥物結(jié)合后能夠抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，然而在乳腺癌中是否也有相同作用，目前尚未見報(bào)道。本研究通過體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞并給予丙泊酚聯(lián)合卡鉑處理，以探究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、乳腺癌細(xì)胞MCF-7 購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，置入-80℃冰箱冷凍保存，使用時(shí)取出，放置37℃解凍，置于RPMI 1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，加入0.25%胰酶溶液進(jìn)行消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第3 代時(shí)，可用于后續(xù)研究。

1.2 儀器與試劑

丙泊酚購自美國(guó)Sigma 公司，卡鉑購自上海賽默飛公司，胎牛血清以及含青霉素、鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco 公司，胰酶溶液購自上海碧云天生物研究所，鼠抗人p-JAK2、p-STAT3、β-actin抗體購自美國(guó)Santa Cruz 公司，Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗購自美國(guó)R＆D 公司，PDVF 膜購自生工生物工程（上海）有限公司，二聯(lián)喹啉酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Thermo 公司，電子熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，蛋白凝膠成像儀購自Bio-Red 公司。

1.3 細(xì)胞分組

取對(duì)數(shù)期MCF-7 細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/ml，培養(yǎng)24 h 將細(xì)胞分為4 組：對(duì)照組、丙泊酚組（100 μmol 丙泊酚組）[5]、卡鉑組（20 μmol/L 卡鉑組）[6]、聯(lián)合組（100 μmol 丙泊酚+ 20 μmol/L 卡鉑組）。

1.4 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.4.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞處理后置于37℃、5% CO2潮濕培養(yǎng)箱內(nèi)，每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，以不接種細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白孔，分別培養(yǎng)24、48、72 和96 h，結(jié)束后添加CCK-8 試劑孵育4 h，離心后保留下層細(xì)胞添加DMSO 避光孵育15 min，置于酶標(biāo)儀570 nm 處檢測(cè)光密度（OD）值，細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）× 100%。

1.4.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞分組后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，接種在含蓋玻片6 孔板內(nèi)，過夜孵育更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上層培養(yǎng)液，PBS 漂洗后添加10%甲醛固定1 h，PBS 清洗后，添加Hoechst33342 染液染色20 min，沖洗后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 變化。

1.4.3 細(xì)胞菌落形成檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，密度調(diào)整為300 個(gè)/ml，于培養(yǎng)皿（直徑60 mm）孵育24 h 后，進(jìn)行上述不同處理后，于37℃下培養(yǎng)2 周，將菌落用固定劑（甲硫醇∶冰醋酸=7 ∶1）固定15 min 后，用含結(jié)晶紫20%甲醇染液對(duì)菌落染色30 min，清洗晾干后拍照計(jì)數(shù)菌落形成個(gè)數(shù)。

1.4.4 PI/Annexin V-FITC 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞添加0.2%胰酶溶液消化，細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，采用預(yù)冷PBS 清洗后，加入150 μl結(jié)合緩沖液重懸，隨后添加5 μl PI、10 μl Annexin V-FITC，置于4℃冰箱中避光條件下孵育30 min，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡情況。

1.4.5 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá) 采用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，冰上孵育30 min 后，離心取上清液，使用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中總蛋白。采用10% SDS-PAGE 凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上，加入BSA 室溫下封閉后，添加一抗稀釋液（1 ∶500）在室溫下孵育1 h。PBS 清洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG 二抗稀釋液（1 ∶5 000）室溫下與膜孵育1 h，通過ECL 化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光顯影，采用Image J 軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各組細(xì)胞的抑制率逐漸升高。同一時(shí)間點(diǎn)，丙泊酚組、卡鉑組細(xì)胞抑制率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丙泊酚組、卡鉑組均升高；聯(lián)合組細(xì)胞抑制率與丙泊酚組、卡鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組均升高。見表1。

表1 各組MCF-7 細(xì)胞抑制率比較 （%，±s）

表1 各組MCF-7 細(xì)胞抑制率比較 （%，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與丙泊酚組、卡鉑組比較，P ＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h 96 h對(duì)照組 4.09±0.32 6.13±0.25 9.19±0.34 13.21±0.68丙泊酚組 10.18±1.531） 12.22±2.091） 14.29±2.191） 18.32±2.161）卡鉑組 11.19±1.761） 13.24±3.141） 15.13±3.241） 19.16±2.851）聯(lián)合組 21.45±2.752） 26.53±3.372） 30.72±2.682） 34.71±3.482）F 值 94.963 69.110 91.939 81.614 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

Hoechst 染色顯示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)、大小均正常，丙泊酚組、卡鉑組細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度增大，部分出現(xiàn)碎片化，聯(lián)合組細(xì)胞核固縮現(xiàn)象更加明顯。見圖1。

2.3 細(xì)胞克隆形成情況

丙泊酚組、卡鉑組細(xì)胞菌落數(shù)量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丙泊酚組、卡鉑組均降低；聯(lián)合組細(xì)胞菌落數(shù)量與丙泊酚組、卡鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組降低。見表2和圖2。

圖1 細(xì)胞染色結(jié)果 （Hoechst 染色 ×100）

2.4 細(xì)胞凋亡情況

丙泊酚組、卡鉑組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丙泊酚組、卡鉑組均升高；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率與丙泊酚組、卡鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組升高。見表3和圖3。

表2 細(xì)胞菌落數(shù)量比較 （個(gè)，±s）

表2 細(xì)胞菌落數(shù)量比較 （個(gè)，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與丙泊酚組、卡鉑組比較，P ＜0.05

組別 菌落數(shù)量對(duì)照組 74.37±11.69丙泊酚組 59.86±12.561）卡鉑組 60.36±9.271）聯(lián)合組 23.49±4.682）F 值 82.963 P 值 0.000

圖2 細(xì)胞菌落形成情況

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較 （%，±s）

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較 （%，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與丙泊酚組、卡鉑組比較，P ＜0.05

組別 凋亡率對(duì)照組 0.28±0.03丙泊酚組 4.75±0.561）卡鉑組 4.83±0.781）聯(lián)合組 16.27±4.222）F 值 61.852 P 值 0.000

圖3 細(xì)胞凋亡情況

2.5 不同細(xì)胞系中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)

MCF-7 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），MCF-7 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)均升高。見表4和圖4。

2.6 各 組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)

丙泊酚組、卡鉑組Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丙泊酚組、卡鉑組Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)與均升高，丙泊酚組、卡鉑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），丙泊酚組和卡鉑組均降低。見表5和圖5。

表4 各細(xì)胞系p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)比較 （±s）

表4 各細(xì)胞系p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)比較 （±s）

注：?與MCF-10A 細(xì)胞系比較，P ＜0.05

細(xì)胞系 p-JAK2 p-STAT3 MCF-10A 0.14±0.03 0.21±0.04 MCF-7 0.87±0.11? 0.83±0.13?t 值 15.158 13.371 P 值 0.000 0.000

圖4 MCF-10A、MCF-7 細(xì)胞中p-JAK2、 p-STAT3 蛋白表達(dá)

表5 各組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)比較 （±s）

表5 各組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與丙泊酚組、卡鉑組比較，P ＜0.05

組別 p-JAK2 p-STAT3 Bax Bcl-2 Cleaved Caspase-3對(duì)照組 1.09±0.14 1.01±0.14 0.18±0.04 1.05±0.17 0.16±0.04丙泊酚組 0.68±0.051） 0.49±0.061） 0.65±0.081） 0.56±0.041） 0.52±0.061）卡鉑組 0.66±0.091） 0.51±0.071） 0.69±0.061） 0.55±0.081） 0.55±0.041）聯(lián)合組 0.32±0.042） 0.23±0.082） 1.17±0.132） 0.17±0.092） 1.08±0.092）F 值 53.446 71.293 41.545 60.440 51.791 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 各組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)情況

3 討論

鉑類藥物在臨床腫瘤治療中應(yīng)用較廣泛，其能夠通過與腫瘤細(xì)胞DNA 發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而影響細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞的增殖，引發(fā)細(xì)胞死亡。研究顯示卡鉑單藥對(duì)乳腺癌的總緩解率可達(dá)50%，體外研究顯示，采用不同濃度卡鉑處理乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞的抑制率升高，且細(xì)胞凋亡率也隨之升高，提示卡鉑能夠阻礙乳腺癌細(xì)胞體外增殖，并且可以誘導(dǎo)其凋亡[7]。丙泊酚為臨床常用靜脈麻醉藥物，具有起效快、蘇醒快、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。近期研究顯示丙泊酚能具有抗腫瘤的作用，在肺癌中研究顯示，丙泊酚通過阻斷金屬基質(zhì)蛋白酶表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制肺癌細(xì)胞的增殖[8]。有結(jié)腸癌研究[9]顯示，丙泊酚能夠通過抑制ERK 信號(hào)通路活性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果均顯示丙泊酚具有抑制腫瘤增殖的作用。卡鉑在治療腫瘤時(shí)，近期療效較好，但易產(chǎn)生耐藥性，據(jù)報(bào)道，丙泊酚能夠抑制耐藥性腫瘤細(xì)胞，同時(shí)對(duì)敏感性細(xì)胞無影響[4]?；谝酝芯客茰y(cè)，丙泊酚聯(lián)合卡鉑可能會(huì)增強(qiáng)卡鉑抗腫瘤效果，本研究結(jié)果顯示，丙泊酚與卡鉑兩者聯(lián)合后細(xì)胞抑制率升高，提示兩者結(jié)合后，共同抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。但具體作用機(jī)制尚不明確。

一般情況下，細(xì)胞凋亡多出現(xiàn)于衰老、病變細(xì)胞，因此清除衰老、病變細(xì)胞，對(duì)維持機(jī)體健康狀態(tài)十分重要；當(dāng)受到外界刺激或內(nèi)部刺激時(shí)，細(xì)胞其生長(zhǎng)和凋亡相關(guān)的基因發(fā)生失調(diào)，導(dǎo)致凋亡程序紊亂，引起細(xì)胞異常凋亡，進(jìn)而引發(fā)病理性損傷[10]。研究顯示丙泊酚能夠通過影響上調(diào)miR-let7i 進(jìn)而誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞的凋亡[11]。體外研究顯示卡鉑處理后能夠明顯抑制人肺腺癌、宮頸癌細(xì)胞的增殖，且誘導(dǎo)其凋亡[12]。以上研究均提示丙泊酚、卡鉑均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示丙泊酚組、卡鉑組細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度增大，部分出現(xiàn)碎片化，且流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)用藥組升高，提示經(jīng)聯(lián)合處理后腫瘤細(xì)胞凋亡更為明顯。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞自主死亡的生物過程，其發(fā)生的涉及凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡抑制因子等調(diào)節(jié)因子[13]。Bcl-2 家族包括多種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白成員，包括抑凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bcl-2 相關(guān)X 蛋白Bax 等成員[14]。一般情況下，細(xì)胞線粒體中Bcl-XL、Bcl-2 通過結(jié)合Bax 形成二聚體抑制細(xì)胞調(diào)亡；受到外界損傷后，Bax 蛋白表達(dá)升高，導(dǎo)致二聚體增多并聚集在線粒體膜，使線粒體膜通透性升高，促使AIF 等凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組，Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)均升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)均降低，與丙泊酚組、卡鉑組有差異，提示經(jīng)丙泊酚、卡鉑處理后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)一定凋亡，聯(lián)合處理后細(xì)胞凋亡更為明顯，進(jìn)一步說明兩者聯(lián)合使用可進(jìn)一步抑制腫瘤增殖。

酸激酶JAK/轉(zhuǎn)錄因子STAT 信號(hào)（JAK/STAT）信號(hào)通路在多類細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)發(fā)生中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子與受體結(jié)合后形成二聚體且與JAK 靠近，進(jìn)而被酪氨酸殘基磷酸化，吸引轉(zhuǎn)錄因子STAT 與受體結(jié)合，使STAT 磷酸化進(jìn)而與受體解離形成二聚體，逐漸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)參與下游靶基因的調(diào)控，因而JAK 的磷酸化后能夠激活STAT磷酸化，進(jìn)而引發(fā)下游抗腫瘤凋亡因子表達(dá)失調(diào)，引發(fā)腫瘤，因此JAK/STAT 信號(hào)通路可能為治療癌癥的靶點(diǎn)[17]。滕文靜等[18]研究顯示，重樓皂苷抑制JAK/STAT3 信號(hào)通路活化進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。楊慧梅等[19]研究顯示，在添加JAK/STAT 信號(hào)通路抑制劑后能夠促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。以上研究均提示抑制JAK/STAT 信號(hào)通路能夠促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本研究顯示，與對(duì)照組比較，丙泊酚組、卡鉑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)均降低，聯(lián)合組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，提示丙泊酚聯(lián)合卡鉑可能通過抑制JAK/STAT 信號(hào)通路活化，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，丙泊酚聯(lián)合卡鉑可能通過抑制JAK/STAT 信號(hào)通路活化，上調(diào)凋亡蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制乳腺癌生長(zhǎng)，發(fā)揮抗腫瘤作用，這可能為乳腺癌細(xì)胞治療的靶點(diǎn)，然而本研究?jī)H以乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 作為研究對(duì)象，所涉及相關(guān)信號(hào)通路還有待深入探究。