鄭慶凱，張曉萍，邵潤霞

（1.焦作市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 焦作 454000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 河南 鄭州 450014）

肺癌已成為人類癌癥死亡的首要原因，其中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%，由于臨床缺乏早期有效診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，其5年生存率仍少于15%[1]。我國每年約有40 萬人被確診患有肺癌，且預(yù)計到2025年，人數(shù)將達(dá)到100 萬人/年。因此，尋找能早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類長度約22 個核酸的非編碼內(nèi)源性小RNA，通過與目的基因的3'-非編碼區(qū)（3'-UTR）相結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動[2]。研究表明，miRNAs 的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相 關(guān)，如miR-509-5p[3]、miR-512-5p[4]、miR-513[5]等。據(jù)報道，miR-433 在多種腫瘤中的表達(dá)下調(diào)，且發(fā)揮抑癌的作用，如口腔鱗狀細(xì)胞癌[6]、結(jié)直腸癌[7]等，而其在肺癌中的表達(dá)及具體的作用機(jī)制尚未見報道，因此，本文旨在研究miR-433 對A549 細(xì)胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

NSCLC 細(xì) 胞 系A(chǔ)549、NCI-H1299、NCI-H358，人肺成纖維細(xì)胞系HFL1，HEK293 細(xì)胞等購自美國Abcam 公司；DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素100 u/ml、鏈霉素100 mg/ml 購自美國Gibco 公司，miR-433 模擬物（miR-433 mimic）以及模擬物對照（mimic control）均由廣州銳博生物科技有限公司合成，LipofectamineTM3000 購自Thermo Fisher Scientific，Trizol購自美國Invitorgen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa 公司，MTT、RIPA 裂解購自美國Sigma 公司，Transwell 小室購自美國BD Biosciences 公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司，兔抗人p21 活化激酶4 （p21-activated kinase 4,PAK4）、單絲氨酸蛋白激酶1（LIM domain kinase 1,LIMK1）、磷酸化單絲氨酸蛋白激酶1（phospho-LIM domain kinase 1,p-LIMK1）多克 隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗人絲切蛋白（Cofilin）和磷酸化絲切蛋白（p-cofilin）多克隆抗體購自美國CST 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)生長情況，每2 ～4 天傳代1 次，取對數(shù)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將A549細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合時，按照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分為空白對照組、miR-433 mimic（50、80 及100 nmol/L）組、mimic control 組。轉(zhuǎn)染48 h 后，Real-time PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率，選取最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 real-time PCR 檢測miR-433 水平

收集細(xì)胞，利用Trizol 法提取總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，再按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書于ABI 7500 儀器（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行real-time PCR，具體反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)。目的基因表達(dá)量按照2-△△Ct法計算。

1.5 MTT 檢測細(xì)胞活力

將處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞以1×105個/ml 濃度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于轉(zhuǎn)染48 h 后加入5 μg/μl 的MTT 溶液20μl，孵育4 h 后每孔分別加入150 μl 的DMSO 溶液，最后于490 nm 波長處檢測各組吸光度（Absorbance,A）值。

1.6 Transwell 檢測細(xì)胞遷移能力

將A549 細(xì)胞調(diào)整為2×105個/ml，取200μl 加入到TranswellTM小室內(nèi)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 孔板中加入500 μl 含10%血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，將TranswellTM小室放入24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出。棄掉上室培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定10 min，經(jīng)PBS 清洗后再用1%結(jié)晶紫染色3 min，PBS 清洗小室。最后于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。隨機(jī)選取5 個高倍鏡視野，對穿過底膜的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.7 熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測miR-433 對PAK4 的靶向性

將包含PAK4 野生型（WT）的3'-UTR 的pmir GLO 質(zhì)粒和PAK3 突變型（Mut）的3'-UTR 的pmir GLO 質(zhì)粒分別與miR-433 mimic 和mimic control 轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞，每組各重復(fù)6 個孔，轉(zhuǎn)染后48 h，利用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶活性，同時檢測海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參對照。

1.8 Western blotting 檢測蛋白水平

將處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞以1×105個/ml 濃度接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染48 h 后收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。取30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，分別加入相應(yīng)PAK4（1 ∶1 000 稀釋）、LIMK1/p-LIMK1（1 ∶1 000 稀釋）、cofilin/p-cofilin（1 ∶1 000 稀釋）等一抗，4℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔（1 ∶2 000稀釋）二抗，37℃孵育1 h。加入ECL 發(fā)光劑進(jìn)行顯色，曝光拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析或單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-433 在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)情況

miR-433 在多組間的表達(dá)，經(jīng)單因素方差分析比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.364，P=0.003）。miR-433 在NSCLC 細(xì) 胞 系A(chǔ)549（0.420±0.047）、NCI-H1299（0.510±0.082）、NCI-H358（0.480±0.032）中的表達(dá)與人肺成纖維細(xì)胞系HFL1（1.00±0.12）比較下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 過表達(dá)miR-433 對A549 細(xì)胞增殖的影響

過表達(dá)miR-433 后，不同濃度組間miR-433 表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.321，P=0.004）。與空白對照組（1.00±0.12）比較，50、80 及100 nmol/L 的miR-433 mimic 表達(dá)量分別為（75.06±5.82）、（142.02± 10.25）、（106.89±8.57）可促進(jìn)miR-433 的表達(dá)，其中，80 nmol/L 的miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染后，miR-433 表達(dá)量最高（P＜0.05）（見表1）。80 nmol/L 的miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染對A549 細(xì)胞增殖的影響，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果顯示：①不同時間點(diǎn)的A549 細(xì)胞增殖率有差異（F=11.539，P=0.001）；②3 組間A549 細(xì)胞增殖率有差異（F=6.651，P=0.019），miR-433 mimic 組與mimic control 比較，細(xì)胞增殖能力較低，抑制細(xì)胞增殖效果較好；③miR-433 mimic 組與mimic control 組A549 細(xì)胞增殖率變化趨勢有差異（F= 5.379，P=0.025）。見表1。

表1 80 nmol/L 的miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染對 A549 細(xì)胞增殖的影響 （±s）

表1 80 nmol/L 的miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染對 A549 細(xì)胞增殖的影響 （±s）

組別 24 h 48 h 72 h空白對照組 0.23±0.015 0.72±0.044 1.31±0.072 mimic control 組 0.21±0.023 0.68±0.055 1.28±0.123 miR-433 mimic 組 0.24±0.042 0.51±0.082 0.95±0.071

2.3 過表達(dá)miR-433 對A549 細(xì)胞遷移的影響

Transwell 結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-433 后，空白對照組A549 細(xì)胞遷移數(shù)為（89.25±7.71）個/視野，mimic control 組為（84.33±8.32）個/視野，miR-433 mimic 組為（31.76±4.66）個/視野，3 組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.991，P=0.020）。與mimic control 組比較，miR-433 mimic 組A549 細(xì)胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.4 miR-433 對PAK4 的靶向性

圖1 miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染對A549 細(xì)胞遷移的影響

Target Scan Human 7.0 軟件預(yù)測結(jié)果表明，PAK4為miR-433 的潛在靶基因。熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染野生型PAK4 3'-UTR 的質(zhì)粒時，與mimic control 組比較，miR-433 mimic 可抑制相對熒光素酶活性[（1.00±0.13）VS（0.42±0.09）（P=0.015）]，而在轉(zhuǎn)染突變型PAK4 3'-UTR 的質(zhì)粒時，miR-433 mimic 對相對熒光素酶活性無影響[（0.95±0.09） VS（0.91±0.07）] （見圖2A）。此外，real-time PCR 和Western blotting結(jié)果顯示PAK4在3種人NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2B 和表2）。

圖2 miRNA-433 靶基因檢測結(jié)果

表2 不同細(xì)胞中PAK4 mRNA 和蛋白的相對表達(dá) （±s）

表2 不同細(xì)胞中PAK4 mRNA 和蛋白的相對表達(dá) （±s）

注：?與HFL1 比較，P ＜0.05

組別 PAK4 mRNA PAK4 蛋白HFL1 1.00±0.12 1.00±0.08 A549 4.67±0.34? 3.25±0.21?NCI-H1299 4.86±0.42? 3.35±0.39?NCI-H358 5.01±0.68? 3.38±0.15?

2.5 過表達(dá)miR-433 對PAK4/LIMK1/Cofilin 信號通路的影響

由表3和圖3可見，miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染后，3 組間PAK4、p-LIMK1 和p-Cofilin 的相對表達(dá)水平經(jīng)單因素方差分析比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與mimic control 組比較，miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PAK4、p-LIMK1 以及p-Coflilin 的相對表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染對PAK4/LIMK1/Cofilin 表達(dá)的影響 （±s）

表3 miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染對PAK4/LIMK1/Cofilin 表達(dá)的影響 （±s）

組別 PAK4 p-LIMK1 p-Coflilin空白對照組 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.07 mimic control 組 1.13±0.08 1.12±0.06 1.08±0.12 miR-433 mimic 組 0.46±0.05 0.34±0.08 0.16±0.08 F 值 5.165 8.491 18.365 P 值 0.015 0.009 0.000

圖3 miR-433 mimic 轉(zhuǎn)染對PAK4/LIMK1/Cofilin 信號通路的影響

3 討論

研究報道，miR-433 編碼的基因位于第12 號染色體，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。如miR-433 通過靶向調(diào)節(jié)Notch1 的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移[9]；miR-433 通過抑制環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移[10]。本研究結(jié)果表明，miR-433 在A549、NCI-H1299、NCI-H358 等NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)下降，且過表達(dá)miR-433 可抑制A549 細(xì)胞增殖及遷移。說明miR-433 可能在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定的抑癌作用。

PAK4 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的成員，是Rho-GTP 酶家族的下游效應(yīng)器。PAK4 在各種細(xì)胞生命活動中具有重要的作用，其表達(dá)異常即可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等[11]。已有研究報道，PAK4 在多種腫瘤中異常表達(dá)，如胃癌中的p-PAK4呈高表達(dá)，與胃癌不良預(yù)后相關(guān)[12]；高表達(dá)的PAK4 可通過激活PI3K/Akt 通路促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[13]。此外，PAK4 在肺癌組織中呈異常高表達(dá)[14]，本研究結(jié)果同樣顯示，PAK4 在3 種NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)上升，且發(fā)現(xiàn)PAK4 為miR-433 的靶向調(diào)節(jié)基因，過表達(dá)miR-433 后PAK4 的表達(dá)降低。

LIMK1 是PAK4 下游的靶蛋白，通過調(diào)節(jié)Cofilin的磷酸化水平調(diào)節(jié)激動蛋白細(xì)胞骨架的重組，參與腫瘤血管形成、細(xì)胞侵襲和遷移[15]。研究表明，LIMK1/Cofilin信號通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中被激活，如鼻咽癌[16]。本結(jié)果同樣表明，PAK4/LIMK1/Cofilin 信號通路在A549 細(xì)胞中被激活，而過表達(dá)miR-433 可抑制PAK4/LIMK1/Cofilin 信號通路。表明miR-433 對肺腺癌的抑制作用可能是通過抑制PAK4/LIMK1/Cofilin 信號通路實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，miR-433 可通過抑制PAK4/LIMK1/Cofilin 信號通路，抑制A549 細(xì)胞的增殖及遷移，為NSCLC 的治療提供新的靶點(diǎn)及理論基礎(chǔ)。