孫曉旭，王途，周健，劉凱，崔海鵬，謝云鵬，趙娟

（承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis,AS）時，動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積形成粥樣斑塊，從而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死，出現(xiàn)心臟的病理改變。國內(nèi)外大量研究報道，多種心臟疾病與AS 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，互為因果[1-2]。因此，研究心臟的病理改變及發(fā)病機制，對防治AS 具有重要的臨床意義。Urantide 是在人尾加壓素Ⅱ（human urotensin Ⅱ,hU Ⅱ）基礎(chǔ)上衍生而來，目前被認(rèn)為是最有效的肽類U Ⅱ的特異性受體G 蛋白偶聯(lián)受體14（G-proteincoupled receptors 14,GPCR14）的拮抗劑，U Ⅱ與其受體GPCR14 結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Urantide 可加速胸主動脈壁內(nèi)的膠原蛋白降解，抑制U Ⅱ?qū)用}炎癥損傷的促進作用，改善AS 病變程度[3-4]。而Urantide 對AS 大鼠心臟的具體作用及機制尚不清楚。本研究利用大鼠AS 模型，探討Urantide 對AS 大鼠心臟U Ⅱ、GPCR14 基因和蛋白表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及試劑 無特定病原體（SPF）級健康雄性Wistar 大鼠180 只，3 周齡，體重180 ～200 g， 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）-2016-0011，生產(chǎn)合格證：11400700 127208]；Urantide 由蘇州強耀生物公司提供，辛伐他?。╯imvastatin）購自北京諾華制藥有限公司，免疫組織化學(xué)（以下簡稱免疫組化）染色試劑盒（PV-6000）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液（P0013B）、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（P0006）和超敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（Cat P0018）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠U II、GPCR14 均購自上海Santa 公司，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗購自美國Bioworlde 公司，Trizol（DP405-02）、TIAN Script cDNA 第一鏈合成試劑盒（KR104）、Super Real Pre Mix SYBR Green（FP204）均購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 大鼠AS 模型復(fù)制及實驗分組 高脂飼料配制：基礎(chǔ)飼料，膽固醇35%，豬油10%，丙硫氧嘧啶0.2%，膽酸鈉0.5%，白糖5%。Wistar 大鼠180 只隨機分為2 組。正常組30 只，飼以普通飼料；模型組150 只，在實驗開始時飼以高脂飼料，并在此基礎(chǔ)上每只大鼠連續(xù)3 d 給予腹腔注射維生素D3150 u/（kg·d），實驗周期為4 周[3-6]。AS 模型復(fù)制成功后，將150 只模型組大鼠又隨機分為3 組：AS 模型組（AS 組）30 只，陽性藥辛伐他汀組（辛伐他汀組）30 只，Urantide 3、7 和14 d 組90 只（給藥時間分別為3、7 和14 d，每組30 只）。正常組和AS 組每只大鼠每日尾靜脈注射生理鹽水30 μg/kg，連續(xù)14 d；辛伐他汀組每只大鼠每日灌胃辛伐他汀5 μg/kg，連續(xù)14 d；Urantide 組每只大鼠每日尾靜脈注射Urantide 30 μg/kg，給藥時間分別為3、7 和14 d。

1.1.3 樣本采集 各組大鼠均采用小動物麻醉機吸入式麻醉安樂死方法處理。胸主動脈樣本采集：麻醉取血后，立即摘取胸主動脈，生理鹽水洗去血跡后，4%多聚甲醛固定，大鼠胸主動脈經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制備成石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、常規(guī)HE 染色后，光學(xué)顯微鏡下拍照觀察病理學(xué)變化。心臟樣本采集：摘取胸主動脈后，立即摘取心臟，生理鹽水洗去血跡后，一部分標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，待形態(tài)學(xué)檢測；另一部分冷凍于液氮進行分子生物學(xué)檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化法檢測大鼠心臟U Ⅱ和GPCR14 的表達 心臟經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后，應(yīng)用LEICA（上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，RM2255）切片機將組織切為3 ～4 μm 的蠟帶，然后進行免疫組化染色。應(yīng)用病理圖形分析軟件IP win32 對圖像中陽性表達進行統(tǒng)計分析，計算各組大鼠心肌中U Ⅱ與GPCR14 陽性顆粒表達的光密度（OD）值。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測大鼠心臟U Ⅱ與GPCR14 mRNA 的表達 Trizol法提取心臟組織總RNA，紫外分光光度計進行定量檢測，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR 檢 測U Ⅱ、GPCR14、GAPDH mRNA 的Ct 值，引物序列見表1，擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火34 s，40 個循環(huán)；做熔解曲線。以各基因Ct 值與GAPDH mRNA Ct 值的差值為△Ct，采用2-△△Ct法計算各基因mRNA 的相對表達水平，并以正常組為參照做歸一處理，其他各組與其做比較。

1.2.3 Western blotting 檢測大鼠心臟U Ⅱ與GPCR14蛋白的表達 RIPA 裂解液提取組織樣本的總蛋白，Bradford 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。45 μg蛋白于SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)膜，封閉，U Ⅱ（1 ∶200）、GPCR14（1 ∶100）、GAPDH（1 ∶10 000）兔抗大鼠一抗4℃孵育過夜。加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1 ∶5 000），37℃孵育1 h，洗膜后用超敏ECL 試劑盒顯影。利用Image J 光密度分析軟件對各蛋白目的條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值的比值作為各蛋白質(zhì)的相對表達水平。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS 大鼠胸主動脈的形態(tài)學(xué)改變

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠胸主動脈內(nèi)膜、中膜、外膜結(jié)構(gòu)完整清楚，內(nèi)皮細(xì)胞完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，且外彈力板結(jié)構(gòu)清晰，呈環(huán)形排列，外膜由疏松結(jié)締組織構(gòu)成；AS 組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞破壞，出現(xiàn)鈣化及炎癥細(xì)胞浸潤，平滑肌細(xì)胞增殖、萎縮，彈力纖維破壞、變薄，內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積形成AS 斑塊，呈典型的AS 病理改變。表明，腹腔注射維生素D3及高脂飼料喂養(yǎng)的方法4 周后成功復(fù)制大鼠AS 模型。見圖1。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

各組大鼠心臟U Ⅱ與GPCR14 陽性表達經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。AS 組大鼠心臟U Ⅱ及GPCR14 陽性表達較正常組增多（P＜ 0.05），且多表達于血管周圍及病變部位。與AS 組比較，經(jīng)Urantide 治療后Urantide 組大鼠心臟U Ⅱ及GPCR14 陽性表達減少（P＜0.05），其效果接近辛伐他汀組的表達水平（P＜0.05）。見圖2、3 和表2。

2.3 各組大鼠心臟U Ⅱ及GPCR14 mRNA 表達

圖1 AS 大鼠胸主動脈形態(tài)學(xué)改變 （HE×400）

圖2 大鼠心臟U Ⅱ免疫組化染色結(jié)果 （×200）

圖3 大鼠心臟GPCR14 免疫組化染色結(jié)果 （×200）

表2 各組大鼠心臟U Ⅱ和GPCR14 OD 值的比較 （n =30，±s）

表2 各組大鼠心臟U Ⅱ和GPCR14 OD 值的比較 （n =30，±s）

注：1）與AS 組比較，P ＜0.05；2）與辛伐他汀組比較，P ＜0.05

組別 U Ⅱ GPCR14正常組 0.16±0.041） 0.08±0.031）AS 組 1.66±0.15 1.20±0.06辛伐他汀組 0.69±0.131） 0.27±0.041）Urantide 3 d 組 0.80±0.041）2） 0.83±0.061）2）Urantide 7 d 組 0.58±0.071）2） 0.50±0.081）2）Urantide 14 d 組 0.61±0.071）2） 0.31±0.071）2）F 值 85.254 122.241 P 值 0.000 0.000

各組大鼠心臟U Ⅱ與GPCR14 mRNA 表達經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。AS組大鼠心臟U Ⅱ及GPCR14 mRNA 表達較正常組升高（P＜0.05）。與AS 組比較，經(jīng)Urantide 治療后各Urantide 組大鼠心臟U Ⅱ及GPCR14 mRNA 表達降低（P＜0.05），其效果接近辛伐他汀組的表達水平（P＜ 0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠心臟U Ⅱ及GPCR14 蛋白表達

各組大鼠心臟Ⅱ與GPCR14 蛋白表達經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。AS 組大鼠心臟U Ⅱ及GPCR14 蛋白表達較正常組升高（P＜ 0.05）。經(jīng)Urantide 治 療 后 各Urantide 組 大 鼠 心 臟U Ⅱ及GPCR14 蛋白表達降低（P＜0.05），其效果接近辛伐他汀組的表達水平（P＜0.05）。見表4和圖4。

表3 各組大鼠心臟U Ⅱ和GPCR14 的mRNA 表達 （n =30，±s）

表3 各組大鼠心臟U Ⅱ和GPCR14 的mRNA 表達 （n =30，±s）

注：1）與AS 組比較，P ＜0.05；2）與辛伐他汀組比較，P ＜0.05

組別 U Ⅱ mRNA GPCR14 mR NA正常組 1.00±0.011） 1.00±0.081）AS 組 2.30±0.05 2.30±0.05辛伐他汀組 1.10±0.021） 1.20±0.041）Urantide 3 d 組 1.40±0.031）2） 1.32±0.061）2）Urantide 7 d 組 1.25±0.041）2） 1.48±0.071）2）Urantide 14 d 組 1.20±0.081）2） 1.10±0.091）2）F 值 67.125 64.100 P 值 0.000 0.000

表4 各組大鼠心臟U Ⅱ和GPCR14 的蛋白表達 （n =30，±s）

表4 各組大鼠心臟U Ⅱ和GPCR14 的蛋白表達 （n =30，±s）

注：1）與AS 組比較，P ＜0.05；2）與辛伐他汀組比較，P ＜0.05

組別 U Ⅱ蛋白 GPCR14 蛋白正常組 0.34±0.021） 0.50±0.011）AS 組 0.96±0.01 0.99±0.01辛伐他汀組 0.80±0.031） 0.05±0.001）Urantide 3 d 組 0.70±0.031）2） 0.19±0.001）2）Urantide 7 d 組 0.70±0.031）2） 1.45±0.001）2）Urantide 14 d 組 0.56±0.031）2） 0.13±0.001）2）F 值 89.031 93.428 P 值 0.000 0.000

圖4 大鼠心臟U Ⅱ與GPCR14 的蛋白表達

3 討論

U Ⅱ是一種生長抑素樣環(huán)肽，最早從魚的脊髓尾部下垂體中分離出來，是目前已知的最強的縮血管活性肽，U Ⅱ與其受體GPCR14 相結(jié)合構(gòu)成U Ⅱ/UT 系統(tǒng)在生理和病理條件下發(fā)揮多種生物學(xué)功能[3]。國內(nèi)外大量研究報道，U Ⅱ不但促進AS 的進展，而且參與了心肌纖維化、心臟重塑、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、心肌肥厚等多種心臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，其有可能成為一個影響因素[7-8]。因此，以U Ⅱ為靶點，保護心臟、治療AS 成為人們關(guān)注的熱點。

Urantide 由hU Ⅱ衍生而來，目前被認(rèn)為是最有效的U Ⅱ受體GPCR14 拮抗劑[3]。CERNARO 等[9]研究報道，Urantide 可以降低由U Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的纖維連接蛋白的表達，在心肌纖維化中具有抗纖維化的作用。國內(nèi)外有關(guān)Urantide 與動脈粥樣硬化心臟的報道極少，迄今可查到的信息，基本上都來自本課題組所做的工作。本研究室前期研究證明，在體內(nèi)實驗中，U Ⅱ及其受體GPCR14 基因與蛋白在AS大鼠胸主動脈中大量表達，且U Ⅱ可促進炎癥因子的釋放，而Urantide 可以下調(diào)其表達量，減輕胸主動脈的炎癥損傷，起到保護胸主動脈的作用；在體外實驗中，U Ⅱ可以促進血管平滑肌細(xì)胞的增殖，上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中U Ⅱ與其受體GPCR14 基因與蛋白的表達水平，促進炎癥因子的釋放，Urantide 則可以下調(diào)其表達量，對血管平滑肌細(xì)胞中的炎癥因子具有抑制調(diào)作用，從而改善AS 病理改變[10]。

本結(jié)果顯示，Urantide 作為U Ⅱ受體GPCR14 的拮抗劑，可減少大鼠心臟U Ⅱ、GPCR14 的陽性顆粒表達；qRT-PCR 及Western blotting 結(jié)果進一步證實Urantide 對AS 大 鼠 心 臟U Ⅱ、GPCR14 mRNA 及 蛋白質(zhì)表達水平均具有下調(diào)作用。筆者推測，U Ⅱ與其受體GPCR14 結(jié)合后可加重AS 大鼠的心臟損傷，而Urantide 則可阻斷U Ⅱ這種促進作用，減輕大鼠AS病理改變。

綜上所述，Urantide 可以通過降低AS 大鼠心臟U Ⅱ及其受體GPCR14 的基因及蛋白質(zhì)的表達水平，而起到對抗損傷、保護心臟，治療AS 的作用。但有關(guān)于Urantide 對AS 大鼠心臟的具體作用機制，還需進一步研究，以期為臨床應(yīng)用Urantide 治療AS 提供更多的實驗依據(jù)。