王勝鋒 黃毅 廖芬艷 曾紅宇 許崗

摘 要：該文提出了一種基于酶法轉(zhuǎn)化乳酸制備D-丙氨酸的方法。首先，采用乳酸氧化酶催化氧化乳酸生產(chǎn)丙酮酸，然后利用D-氨基酸脫氫酶將丙酮酸還原成D-丙氨酸，在此過程中加入D-氨基酸脫氫酶、甲酸脫氫酶和NADP，構(gòu)建了輔酶再生體系。乳酸被氧化過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物過氧化氫，會導(dǎo)致丙酮酸的降解，通過添加過氧化氫酶除去過氧化氫。通過優(yōu)化工藝條件，D-丙氨酸的轉(zhuǎn)化總摩爾收率能達(dá)到64.9 %，產(chǎn)品的ee值達(dá)到99.9 %。該研究制備D-丙氨酸相對于傳統(tǒng)方法，具有工藝環(huán)保、成本低，質(zhì)量好等優(yōu)點，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：乳酸；乳酸氧化酶；丙酮酸；D-氨基酸脫氫酶；甲酸脫氫酶；D-丙氨酸

中圖分類號：Q935 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 前言

D-丙氨酸作為一種重要的手性化合物，已經(jīng)在制藥、食品、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。它是生產(chǎn)維生素B6的原料，有鎮(zhèn)痛的作用；還是一種甜味劑，是合成二肽阿力甜的重要原料。同時，它還有抑菌的作用，可用作化妝品的添加劑等。

常規(guī)D-丙氨酸的生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)周期長、投資大，且制備的D-丙氨酸光學(xué)純度不高?；瘜W(xué)法主要有不對稱合成和手性拆分的方法，不對稱合成需要較為昂貴的催化劑，成本高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。手性拆分原料成本高，且有一半的L-丙氨酸需要去除，手性純度難以保證。以5-甲基海因為底物通過外消旋后，再用海因酶和氨甲酰水解酶制備D-丙氨酸，此方法消旋速度慢，條件苛刻，難以工業(yè)化。

酶法合成D-丙氨酸工藝以其高效催化、綠色環(huán)保等特點引起了研究者的關(guān)注。最近，朱敦明課題組報道了采用以α酮酸為底物，利用共固定化的二氨基庚二酸脫氫酶和甲酸脫氫酶制備D-丙氨酸，該方法以NADH為輔酶，催化α酮酸直接轉(zhuǎn)化為D-丙氨酸，產(chǎn)品光學(xué)純度>98 %。該工藝的不足之處是采用酮酸為原料，成本較高。該文針對該方法的缺點開發(fā)了一種酶法制備D-丙氨酸的新方法。采用價格比丙酮酸低10倍的廉價材料乳酸為底物，先采用乳酸氧化酶（LOD）催化乳酸制備丙酮酸，然后采用D-氨基酸脫氫酶（DAADH）和NADP（H）轉(zhuǎn)化丙酮酸為D-丙氨酸。中間加入甲酸脫氫酶（PFDH），與DAADH和NADP（H）構(gòu)成了輔酶再生體系，轉(zhuǎn)化過程如圖1所示。該方法成本較低、產(chǎn)品光學(xué)純度高，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：過氧化氫酶，0.3 Mu/mL，山東泰安信得利生物工程有限公司。固定化LOD，100 U/g，PFDH，30 U/mL，DAADH，114 u/mL，均由湖南福來格生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。乳酸，含量80 %，河南金丹乳酸科技股份有限公司。其他試劑均為分析純。實驗所用的水均為超純水。

儀器：氧化反應(yīng)器，上海保興。高效液相色譜，Agilent 1100。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮RE-2000A。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶催化制備乳酸

將pH為7.0濃度為6 %的乳酸溶液導(dǎo)入氧化反應(yīng)器中。然后加入一定量的過氧化氫酶，攪拌0.5 h。取一定量的LOD導(dǎo)入氧化反應(yīng)器中，通入氧氣，開啟反應(yīng)。取樣做HPLC分析，當(dāng)乳酸的殘留小于2 mg/mL時，停止攪拌和通氧，反應(yīng)停止，過濾出反應(yīng)液。

1.2.2 酶催化制備D-丙氨酸

在過濾的丙酮酸溶液中加入2倍丙酮酸摩爾量的甲酸銨，并開啟攪拌，調(diào)節(jié)pH到7.0，將一定量的PFDH、DAADH以及NADP加入轉(zhuǎn)化料液中，開啟反應(yīng)。取樣做HPLC分析，當(dāng)丙酮酸的殘留小于2 mg/mL時，停止攪拌，反應(yīng)停止，采用5K的超濾膜過濾出反應(yīng)液。

1.2.3 結(jié)晶

上述超濾得到的溶液，加入3 ‰活性炭脫色0.5 h，過濾后升溫濃縮，濃縮到一定濃度后，倒入玻璃燒杯中，冰浴降溫到5 ℃后，過濾，干燥，得到D-丙氨酸成品。

2 結(jié)果和討論

2.1 過氧化氫酶加量對LOD催化收率的影響

在LOD氧化乳酸生成丙酮酸的過程中，會產(chǎn)生H2O2，H2O2會對酶產(chǎn)生不利影響，同時也會導(dǎo)致丙酮酸的降解，通過在轉(zhuǎn)化體系中加入過氧化氫酶去除H2O2。該研究考察了過氧化氫酶加量對轉(zhuǎn)化收率的影響。其他反應(yīng)條件為：乳酸濃度6 %，LOD投量為6 000 u/mol，反應(yīng)溫度30 ℃，pH 7.0。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)過氧化氫酶濃度達(dá)到0.15 Mu/mol時，轉(zhuǎn)化的收率基本達(dá)到穩(wěn)定值，繼續(xù)提高過氧化氫酶的濃度，轉(zhuǎn)化的收率基本無增長，因此選擇最佳的過氧化氫酶濃度為0.15 Mu/mol。

2.2 LOD投量對轉(zhuǎn)化的影響

該研究考察了酶添加量對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。其他反應(yīng)條件與2.1所述一樣。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)LOD的加量越大，轉(zhuǎn)化所需時間越短。當(dāng)氧化酶投量為12 500 u/mol時，氧化反應(yīng)在2 h內(nèi)基本達(dá)到平衡，此時的收率僅為40 %。當(dāng)酶的加入量小于8 500 u/mol時，反應(yīng)達(dá)到平衡的時間延長至5 h～6 h，收率也在逐步提高。由于酶的投量越大，反應(yīng)越劇烈，需要的過氧化氫酶的用量也要增加，綜合考慮轉(zhuǎn)化時間和酶應(yīng)用的經(jīng)濟性，酶的投量選擇6 000 u/mol。

2.3 PFDH和DAADH投量對轉(zhuǎn)化速度的影響。

該研究考察了PFDH和DAADH投量對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響，PFDH和DAADH投量以1︰1的比例投入。其他反應(yīng)條件為丙酮酸濃度4 %，NADP投量0.06 g/mol，反應(yīng)溫度為30 ℃，pH為7.0。結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)PFDH和DAADH加量達(dá)到12 000 u/mol后，反應(yīng)5 h基本達(dá)到平衡，收率≥80 %?；诮?jīng)濟性的考慮，選擇PFDH和DAADH投酶量為24 000 u/mol。

2.4 最優(yōu)條件下制備D-丙氨酸的數(shù)據(jù)分析

在最優(yōu)條件下，乳酸濃度6 %，LOD投量為6 000 u/mol，過氧化氫酶0.15 Mu/mol；PFDH和DAADH投量為24 000 u/mol以及NADP量為0.06 g/mol，兩步轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，乳酸氧化成丙酮酸的摩爾收率為70.8 %，丙酮酸轉(zhuǎn)化成D-丙氨酸的收率為92.1 %，總收率為65.2 %。

將轉(zhuǎn)化后的料液進(jìn)行結(jié)晶處理，得到成品，經(jīng)檢測，成品的ee值可達(dá)99.9 %，說明該工藝能夠制備出高純度的D-丙氨酸。

3 結(jié)論

該文提出了一種兩步酶法催化乳酸制備成高純度的D-丙氨酸的方法，通過優(yōu)化各酶投加量等條件，在保證工藝經(jīng)濟性的同時，提高了轉(zhuǎn)化的收率。其中乳酸氧化成丙酮酸的收率達(dá)到70 %，丙酮酸制備成D-丙氨酸的收率達(dá)到80 %，通過分離結(jié)晶后，制備成了高手性純度的D-丙氨酸，其ee值達(dá)到了99.9 %以上。

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