劉海芳，王 凡，姚衛(wèi)云

(1.中原工學(xué)院，鄭州 450007；2.洛陽師范學(xué)院，河南洛陽 471022)

三氯生(triclosan，TCS)，又名三氯新，被廣泛應(yīng)用于各類醫(yī)療用品和生活日用消費用品中[1-2]。由于TCS的大量使用使其在各個環(huán)境介質(zhì)中普遍存在，其主要通過污水廠出水排放進(jìn)入水體和土壤中。目前，已在污水處理廠進(jìn)出水、污泥、河流、河口、沉積物及生物體中檢測到TCS的存在，且其在污水處理廠進(jìn)出口水區(qū)域的最高濃度可達(dá)27 μg/L[3]。現(xiàn)已證實，TCS具有生物蓄積性、穩(wěn)定性和多種其他生物毒性。因此，關(guān)于TCS環(huán)境行為、生態(tài)毒理、健康安全評價等研究已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。

近年來許多學(xué)者已經(jīng)報道了TCS的生物毒效應(yīng)。劉飛等[4]研究證實TCS對紅白鯽具有潛在的遺傳毒性，且隨著在TCS暴露濃度的增加，其毒性效應(yīng)也隨之而增強。危玲等[5]的綜述表明TCS是一種影響生殖的內(nèi)分泌干擾物。陳建軍等[6]研究發(fā)現(xiàn)TCS具有顯著的生理毒性，能夠抑制泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)肝組織中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。Alice等[7]發(fā)現(xiàn)TCS能夠降低魚類孵卵率以及延長孵化時間，對魚類產(chǎn)生顯著的繁殖和發(fā)育影響。迄今為止，對于硬骨魚類TCS分子生物毒性的研究相對較少，尤其在魚類凋亡相關(guān)基因的表達(dá)影響方面。

斑馬魚(DanioRerio)是一種實驗室常用的模式動物，它與人類基因高度相似，經(jīng)常被應(yīng)用到毒理學(xué)和藥理學(xué)的研究中。鰓作為魚類最重要的呼吸器官，可直接反映水體污染物對魚體的毒害程度，通常作為魚類毒性效應(yīng)研究的主要靶器官之一[8]。因此，本研究以斑馬魚為研究對象，利用PCR技術(shù)探討不同濃度的TCS對于斑馬魚鰓組織促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，其主要目的是揭示TCS對于鰓組織損傷的相關(guān)分子機制，同時也為TCS對人類健康提供安全性評價提供支撐材料。

1 材料和方法

1.1 研究對象

試驗用魚購自上海誠信漁場，體長為1.5～2.1 cm，暫養(yǎng)于實驗室玻璃水族箱中馴化7 d，每日定時投喂餌料兩次，吸出餌料殘渣、排泄物等，每日用曝氣72 h的自來水更換養(yǎng)殖用水，水溫(22±3)℃，pH值6.9±0.2，24 h不斷充氧，并確保溶氧量>5 mg/L。然后取大小相似、行為迅速敏捷、健康狀況良好的斑馬魚分組進(jìn)行試驗。

1.2 試驗試劑

三氯生(美國Sigma公司)、總RNA極速提取試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)、2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、GoldView I型核酸染色劑、Bestar SybrGreen qPCR mastermix(德國DBI公司)、二甲基亞砜溶劑(天津紫明化工有限公司)、基因引物(華大基因公司)、瓊脂糖、Loading buffer染料等。

1.3 實驗設(shè)計

查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知TCS對斑馬魚96 h LC50為340 μg/L[9]。在此基礎(chǔ)上，設(shè)置1/20 LC50(17 μg/ L)、1/10 LC50(34 μg/L)、1/5 LC50(68 μg/L)3個TCS處理組(低于安全濃度、安全濃度、高于安全濃度)，并設(shè)置空白對照組，每組同時設(shè)置兩個平行。隨機選擇暫養(yǎng)后的斑馬魚幼魚100尾放置于每一濃度組水族箱中，每個水族箱用水量20 L，以半靜態(tài)水體暴露法對斑馬魚進(jìn)行連續(xù)處理42 d。整個試驗期間其他條件同暫養(yǎng)期間。

1.4 樣本的制備

TCS處理42 d后，選出行動敏捷、生長狀況良好、體表健康的斑馬魚進(jìn)行解剖。每個濃度斑馬魚均分為五組，并且每組取出5條雄性斑馬魚鰓組織的混合樣作為一個樣本。然后迅速轉(zhuǎn)移并保存在超低溫冰箱中用于后期凋亡相關(guān)基因表達(dá)的檢測。

1.5 凋亡相關(guān)基因表達(dá)的檢測

1.5.1 引物序列

Bcl-2、Bax、p53、MDM2、β-actin(內(nèi)參)基因的引物序列來自于相關(guān)報道[9-10]，詳見表1。

表1 PCR所用基因的特異性引物及其序列

1.5.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

按照總RNA 極速抽提試劑盒提供的方法，提取每個雄性斑馬魚的鰓組織混合樣。對提取出的RNA用凝膠電泳分析其質(zhì)量，并用超微量分光光度計檢測其純度和濃度。對質(zhì)量好、濃度適宜、純度高的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5.3 普通PCR

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA加入目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、2×Taq MasterMix及無菌水制備25 μL的普通PCR反應(yīng)體系。將反應(yīng)體系充分混勻，根據(jù)普通PCR步驟進(jìn)行擴增反應(yīng)，其擴增反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。擴增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)，電泳完成后觀察并保存各個基因的表達(dá)結(jié)果。

1.5.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

為鑒定引物特異性是否符合RT-qPCR實驗的要求，在進(jìn)行正式RT-qPCR反應(yīng)之前，用實時熒光定量PCR儀來分析上述引物的特異性。結(jié)果顯示，內(nèi)參基因與各個目的基因融解峰一致，擴增效率都接近100%，這表明所合成的引物可以用于本研究實驗過程中的實時熒光定量PCR反應(yīng)。為了檢驗是否可用2-ΔΔct法來計算目的基因的相對表達(dá)量，對每個基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各個基因的擴增效率都接近100%，這表明可用2-ΔΔct法來計算mRNA的相對表達(dá)量

把反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA、目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物，Bestar SybrGreen qPCR mastermix以及無菌水，配制20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性2 min；循環(huán)條件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，同時檢測熒光信號，40個循環(huán)反應(yīng)；融解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循環(huán)0.5 ℃/循環(huán))86個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對RT-qPCR的Cq值利用2-ΔΔt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用LSD法來分析各個濃度組與空白對照組之間的差異，若P<0.05，則為差異顯著；P<0.01則為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因和內(nèi)參基因的普通PCR反應(yīng)結(jié)果

圖1 內(nèi)參及目的基因在不同濃度組的TCS表達(dá)情況

普通PCR結(jié)果如圖1所示，通過分析每個TCS濃度組Bcl-2、Bax、p53和MDM2基因與內(nèi)參基因(β-actin)灰度值之比的大小來比較目的基因的相對表達(dá)。Bcl-2在各個TCS濃度組的表達(dá)量無明顯變化；p53在各個TCS濃度組的表達(dá)量都有下調(diào)趨勢，表現(xiàn)差異不明顯；MDM2在各個TCS濃度組表達(dá)均有上調(diào)趨勢，但差異表現(xiàn)不明顯；Bax在17、34 μg/L的TCS濃度組表達(dá)量無明顯變化，但在68 μg/L處理組中表達(dá)量有下調(diào)趨勢。以上結(jié)果表明，普通PCR并不能顯著分析出TCS對斑馬魚鰓凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響。

2.2 三氯生對雄性斑馬魚鰓凋亡相關(guān)基因表達(dá)的實時熒光定量分析

圖2 不同TCS濃度組斑馬魚鰓凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

為了證實TCS對斑馬魚鰓的各種抗氧化基因的表達(dá)量的影響，采用RT-qPCR法并分析處理組的表達(dá)與對照之間的差異顯著性。結(jié)果如圖2所示，與空白對照組相比，Bcl-2基因在各個TCS濃度處理組表達(dá)水平都無顯著差異；Bax基因在不同濃度的TCS濃度組中的表達(dá)水平均有下調(diào)趨勢，且在68 μg/L TCS濃度組極顯著下調(diào)，下調(diào)了94.9%；Bcl-2/Bax在17、34 μg/L濃度組中無明顯變化，而在68 μg/L TCS處理組極顯著上升；p53基因在不同濃度的TCS濃度組中的表達(dá)水平均具有下調(diào)趨勢，其中在68 μg/L濃度下表現(xiàn)為顯著下調(diào)，基因表達(dá)下調(diào)了96.3%；MDM2基因在不同濃度的TCS濃度組中的表達(dá)水平均具有上調(diào)趨勢，且在34 μg/L和68 μg/L濃度下表現(xiàn)為極顯著上調(diào)，其上調(diào)幅度分別是空白對照組的6.6倍、10.8倍。

3 討論

Bcl-2與Bax同屬于一個基因家族，在控制細(xì)胞凋亡的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中作用相反。Bcl-2能夠抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[11]。 Bax可以抑制Bcl-2基因的活性，當(dāng)Bcl-2 與 Bax 形成同源二聚體時，便可誘導(dǎo)凋亡[12-15]，在控制細(xì)胞凋亡的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中Bcl-2與Bax比例的變化會影響細(xì)胞凋亡[16]，當(dāng)Bcl-2/Bax比值上升和下降會對細(xì)胞的凋亡分別起到抑制和促進(jìn)的作用。在本研究中，Bcl-2與Bax基因在不同濃度處理組中的基因表達(dá)都有下調(diào)趨勢；Bcl-2與Bax比值在低濃度呈下調(diào)趨勢，但在68 μg/L TCS處理組極顯著上調(diào)。這表明不同濃度的TCS都能夠干擾細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，且可能在低濃度TCS處理組促進(jìn)凋亡，而在68 μg/L處理組中，可能起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。劉林等[17]研究的納米氧化鋅能夠使斑馬魚肝臟中Bcl-2的表達(dá)及Bcl-2/Bax比值下降，表明納米氧化鋅能夠促進(jìn)斑馬魚肝臟細(xì)胞的凋亡；魯疆等[18]的研究發(fā)現(xiàn)CdCl2使斑馬魚胚胎Bcl-2的表達(dá)及Bcl-2/Bax比值顯著下降。上述結(jié)果有的方面和本研究結(jié)果不太一致，可能是由于污染物濃度、種類、暴露時間長短及魚的組織不同所造成的。

p53基因是一種抑癌基因，其編碼產(chǎn)物是核轉(zhuǎn)錄因子[19]，其主要作用是阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外 p53基因的表達(dá)還涉及到維持基因組穩(wěn)定、細(xì)胞自噬、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)代謝、影響生殖等其他方面作用[20-22]。MDM2基因是一類癌基因，其蛋白表達(dá)產(chǎn)物能夠抑制細(xì)胞的凋亡。MDM2基因與p53 基因在基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)系緊密。由MDM2基因編碼的MDM2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的主要功能是通過調(diào)節(jié)p53蛋白的穩(wěn)定性而影響細(xì)胞的生長狀態(tài)[23]，當(dāng)MDM2基因擴增所導(dǎo)致的基因表達(dá)過強則可封閉p53介導(dǎo)的激活作用，使p53功能喪失，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定及細(xì)胞增生，從而抑制細(xì)胞的凋亡。在本研究中p53基因在3個TCS處理組中的表達(dá)水平均有下調(diào)趨勢，并且在68 μg/L處理濃度組中表現(xiàn)出顯著下調(diào)；而MDM2基因在三組不同濃度的TCS處理組中的基因表達(dá)均有上調(diào)趨勢，其34 μg/L和68 μg/L TCS處理濃度組中的基因表達(dá)量為極顯著上調(diào)。因此，在較高濃度的TCS處理組中，能夠抑制斑馬魚鰓組織的細(xì)胞凋亡。該結(jié)果也進(jìn)一步證實了TCS在68 μg/L處理組中，可能起到抑制斑馬魚細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果表明TCS在斑馬魚安全濃度和高于安全濃度情況下，對鰓凋亡相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，而該濃度和污水處理廠進(jìn)出口水區(qū)域的最高濃度接近，由于TCS具有蓄積的特性，因此，TCS對污水廠進(jìn)出口區(qū)域生物的分子毒性應(yīng)該引起重視。

綜上所述，TCS對雄性斑馬魚細(xì)胞凋亡有關(guān)基因的表達(dá)具有一定影響，且在高濃度下，其影響程度更為顯著。由于影響細(xì)胞凋亡的基因較多，控制其基因表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控較復(fù)雜，其調(diào)控機制還需更深層次的研究。