何 智，何治德，2，何 亮，阮會(huì)斌，李 松，嚴(yán)太明

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 瀘州 646000)

半胱氨酸蛋白酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者[1]，活化后直接參與切割細(xì)胞多種結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起細(xì)胞以凋亡的形式解體[2，3]。哺乳動(dòng)物Caspase-3參與了濾泡細(xì)胞凋亡過程[4]，在凋亡中晚期表達(dá)量明顯升高[5，6]。同樣，魚類卵母細(xì)胞凋亡過程也需要Caspase-3的參與[7]。三斑海豬魚(Halichoerestrimaculatus)由雌性向雄性轉(zhuǎn)變期卵母細(xì)胞中檢測(cè)到Caspase-3的大量表達(dá)[8]。熱應(yīng)激誘導(dǎo)銀漢魚(AtherinableekeriGünther)卵母細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-3活性與卵母細(xì)胞的凋亡具有明顯的同步性[9]。

黃鱔(Monopterusalbus)隸屬于合鰓魚目(Synbgranchiformes)合鰓魚科(Synbranchidae)黃鱔屬(Monopterus)[10]，存在由雌性性腺向雄性性腺轉(zhuǎn)變的天然性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。研究證實(shí)黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程伴隨著性腺的凋亡[11]，但其凋亡具體機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過克隆caspase-3的序列，檢測(cè)其mRNA表達(dá)水平和蛋白相對(duì)含量的變化，并定位其在不同發(fā)育時(shí)期的卵母細(xì)胞的表達(dá)位置，探究Caspase-3與黃鱔性逆轉(zhuǎn)的相關(guān)性，期望為揭示黃鱔性逆轉(zhuǎn)機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用黃鱔購自于四川省成都市溫江區(qū)瑞航農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，分別于2017年1月—12月每月取樣1次，每次取樣60尾左右。挑選體質(zhì)健康、不同規(guī)格的黃鱔于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖系實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)24 h后，進(jìn)行不同發(fā)育時(shí)期性腺樣本的收集。性腺組織一部分使用包恩氏液固定，用于發(fā)育時(shí)期鑒定和免疫組化定位；另一部分液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 性腺發(fā)育時(shí)期鑒定和樣本篩選

參照肖亞梅的報(bào)道[13-14]，采用石蠟組織切片進(jìn)行性腺發(fā)育時(shí)期的鑒定，從采集的樣本中挑選卵黃生成中期、間性早期、間性中期、間性晚期和雄性時(shí)期的性腺樣本用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 總RNA提取與cDNA第一鏈合成

使用Invitrogen公司的Trizol Reagent進(jìn)行總RNA提取，cDNA第一鏈合成使用Thermo公司revertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行。

1.4 caspase-3基因中間片段的克隆和序列分析

根據(jù)已報(bào)道的大黃魚(Larimichthyscrocea)、鱖(Sinipercachuatsi)、黑班小丑魚(Amphiprionmelanopus)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、大西洋鮭(Salmosalar)、斑馬魚(Daniorerio)和唐魚(Tanichthysalbonubes)等魚類的caspase-3基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：F：5′-AACAACAAGAACTTTGA-3′與R：5′-ABGCRTAGAGGAAGTC-3′，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系：cDNA 模板l.0 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，2×Mix(0.1 U/μL)10.0 μL，H2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，30 min；12 ℃，forever。PCR結(jié)束后取4 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。將目的產(chǎn)物送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

用BlastX、SeqMan軟件將測(cè)序結(jié)果與其他物種比對(duì)，DNAMAN軟件預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列，MEGA 5.0軟件進(jìn)行同源氨基酸序列比對(duì)，采用鄰位連接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstraps=1 000)。

1.5 不同發(fā)育時(shí)期性腺caspase-3表達(dá)分析

使用獲得的基因序列片段，以及黃鱔elongation factor-1-α(ef1α)和ribosomal protein L17(rpl17)作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)定量檢測(cè)引物(表1)。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[15]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件Tukey法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)的表示方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)，顯著性水平為0.05，每個(gè)數(shù)據(jù)均來自5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 黃鱔caspase-3基因定量分析引物

1.6 Caspase-3相對(duì)含量測(cè)定

將-80 ℃保存的性腺組織樣本融化后保持在2～8 ℃，加入一定量的磷酸緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)后用勻漿器充分勻漿。3 000 r/min，離心2 min，收集上清備用。

樣品中蛋白含量測(cè)定采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供的魚半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒進(jìn)行。同時(shí)，用牛血清白蛋白(BSA)作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，采用BCA總蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品中可溶性總蛋白含量。樣品中Caspase-3蛋白的相對(duì)含量為單位體積勻漿液中酶含量和可溶性總蛋白含量的比值。

1.7 Caspase-3免疫組化定位

Caspase-3抗血清選用抗原與黃鱔肽段具有較高的同源性兔抗血清，購買于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(Abcam公司產(chǎn)品，編號(hào)為ab13847)。

石蠟切片經(jīng)脫蠟至水化，用新配置的3% H2O2室溫(24 ℃)孵育20 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS(pH7.4)浸洗3次(3 min/次)；0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)95 ℃加熱，并持續(xù)15 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS浸洗3次(3 min/次)。正常山羊血清封閉液室溫孵育20 min；滴加第一抗體(PBS 500倍稀釋)，37 ℃放置2 h，PBS浸洗3次(3 min/次)，滴加第二抗體(羊抗兔IgG，武漢博士德公司產(chǎn)品，PBS 1 000倍稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBS浸洗3次(3 min/次)；DAB(武漢博士德公司產(chǎn)品)顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性對(duì)照用PBS代替第一抗體。

2 結(jié)果

2.1 Caspase-3生物信息學(xué)分析

獲得黃鱔caspase-3核苷酸序列長(zhǎng)度為432 bp，編碼氨基酸144個(gè)。基于NJ法構(gòu)建Caspase-3氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，黃鱔與大黃魚(L.crocea)和鱖(S.chuatsi)等聚為一支，親緣關(guān)系較近(圖1)。

圖1 黃鱔和其它物種Caspase-3的NJ系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 Caspase-3在不同發(fā)育時(shí)期黃鱔性腺中的表達(dá)分析

黃鱔caspase-3 mRNA在雌性性腺向雄性性腺發(fā)育的過程中均有表達(dá)，隨著雌性性腺向雄性性腺的發(fā)育表達(dá)量呈下降的趨勢(shì)，并表現(xiàn)出明顯的雌雄差異(P<0.05)。其中，卵黃生成中期、間性早期和間性中期性腺的表達(dá)量差異不顯著，但高于間性晚期和雄性性腺(圖2)。

圖2 黃鱔caspase-3 mRNA在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)分析

2.3 黃鱔不同發(fā)育時(shí)期性腺中Caspase-3相對(duì)含量

Caspase-3相對(duì)含量與黃鱔性腺性逆轉(zhuǎn)過程關(guān)系密切。在性逆轉(zhuǎn)過程中Caspase-3相對(duì)含量呈上升的趨勢(shì)，在間性晚期達(dá)到極大值(圖3)。

圖3 黃鱔Caspase-3在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的相對(duì)含量

2.4 不同發(fā)育時(shí)期黃鱔性腺中Caspase-3定位分析

Caspase-3在黃鱔各發(fā)育時(shí)期性腺中的定位結(jié)果見圖4。在卵黃生成期黃鱔性腺中，Caspase-3主要分布在卵黃積累期卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖4A，a)。間性早期和間性中期黃鱔性腺中，Caspase-3信號(hào)主要分布皮質(zhì)小泡期卵母細(xì)胞的細(xì)胞核和顆粒細(xì)胞、初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖4B，b；圖4C，c)。在間性晚期黃鱔性腺中，Caspase-3信號(hào)主要分布在初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖4D，d)。在陰性對(duì)照中未觀察到Caspase-3明顯的陽性信號(hào)(圖4E)。

圖4 黃鱔Caspase-3在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的定位

3 討論

已有資料表明，哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞在發(fā)生過程中的大量死亡或丟失是屬于細(xì)胞凋亡，這一過程與Caspase-3等Caspases家族蛋白的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)[16]。小鼠和牛卵巢中卵泡閉鎖時(shí)，Caspase-3的表達(dá)能導(dǎo)致凋亡細(xì)胞基因組DNA的特異性降解[17]，猴和綿羊卵母細(xì)胞凋亡程度與Caspase-3活性呈正相關(guān)[6，18]，在人卵巢顆粒細(xì)胞中凋亡過程中也存在類似的現(xiàn)象[18]。同樣，Caspase-3在魚類卵母細(xì)胞的凋亡過程中也扮演了重要角色[20，21]。三斑海豬魚性腺由雌性向雄性變化過程中，卵母細(xì)胞凋亡與Caspase-3蛋白表達(dá)關(guān)系密切[8]。熱應(yīng)激條件下，銀漢魚卵母細(xì)胞凋亡與Caspase-3大量表達(dá)有關(guān)[9]。黃鱔Caspase-3在不同發(fā)育時(shí)期性腺中均有表達(dá)且與性逆轉(zhuǎn)具有明顯的同步性，這表明Caspase-3參與了黃鱔性腺性逆轉(zhuǎn)過程，并和性腺中卵母細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切。

Caspase-3作為細(xì)胞凋亡通路中非常關(guān)鍵的效應(yīng)分子，在細(xì)胞未發(fā)生凋亡時(shí)，以無活性的酶原形式存在，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3被活化[22]。綿羊卵母細(xì)胞受到凋亡促進(jìn)作用時(shí)，Caspase-3活性顯著升高[18]。猴和小鼠卵母細(xì)胞凋亡晚期的Caspase-3活性顯著高于凋亡早期[5-6]。本研究中，caspase-3表達(dá)水平在卵黃生成期最高，在性逆轉(zhuǎn)過程中的間性晚期最低。但Caspase-3相對(duì)含量則呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢(shì),隨著性逆轉(zhuǎn)的發(fā)生，其相對(duì)表達(dá)量呈上升的趨勢(shì)，表現(xiàn)出與性逆轉(zhuǎn)的高度同步性，并在間性晚期達(dá)到極大值。由此推測(cè)，在黃鱔性逆轉(zhuǎn)開始前就已有大量的Caspase-3酶原儲(chǔ)備，隨著性逆轉(zhuǎn)開始，大量的酶原活化，并參與黃鱔卵母細(xì)胞的凋亡。

在人胎兒卵巢組織中，Caspase-3陽性信號(hào)在卵細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，主要定位于卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞核。此外，胎兒卵巢內(nèi)的顆粒細(xì)胞也具有陽性信號(hào)，且其表達(dá)在孕中期及孕晚期均為強(qiáng)陽性[23]。Caspase-3在新生大鼠卵母細(xì)胞細(xì)胞核及其周圍表達(dá)，在顆粒細(xì)胞中也能檢測(cè)到陽性信號(hào)，而卵母細(xì)胞形成原始卵泡和初級(jí)卵泡的過程均未檢測(cè)到陽性信號(hào)[24]。這些結(jié)果表明，Caspase-3在卵母細(xì)胞凋亡中扮演了重要角色。同樣，在鈍齒巨兔脂鯉(Leporinusobtusidens)濾泡閉鎖晚期的濾泡細(xì)胞和膜細(xì)胞能檢測(cè)到大量的Caspase-3陽性信號(hào)，而在閉鎖早期信號(hào)較弱[7]。使用Caspase-3免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)性逆轉(zhuǎn)前后三斑海豬魚卵母細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，在雌性性腺的卵母細(xì)胞中未檢測(cè)到明顯的凋亡信號(hào)，但在性逆轉(zhuǎn)早期的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均檢測(cè)到陽性信號(hào)[8]。本研究中，從間性早期到間性晚期性腺中初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)均有陽性信號(hào)，表明初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞凋亡貫穿性逆轉(zhuǎn)始終；間性早期和間性中期的皮質(zhì)小泡期卵母細(xì)胞細(xì)胞核中有陽性信號(hào)，推測(cè)皮質(zhì)小泡期卵母細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在性逆轉(zhuǎn)早期；卵黃生成期卵母細(xì)胞陽性信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)，主要在卵黃生成中期和間性早期發(fā)生凋亡。Caspase-3陽性信號(hào)在皮質(zhì)小泡期卵母細(xì)胞細(xì)胞核和顆粒細(xì)胞，而在細(xì)胞質(zhì)中未見明顯信號(hào)，這可能是由于皮質(zhì)小泡期卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中迅速沉積和充塞的大量脂滴和卵黃物質(zhì)使得細(xì)胞質(zhì)中陽性信號(hào)變得不明顯。此外，各個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)，而在其濾泡細(xì)胞中未檢測(cè)到明顯的陽性信號(hào)，這可能和其濾泡細(xì)胞并未開始大量增殖和分化為顆粒細(xì)胞有關(guān)。劉修業(yè)等[25]研究結(jié)果也證實(shí)，幼小的卵母細(xì)胞退化方式與體積大的卵母細(xì)胞有所不同，退化完成的時(shí)間比體積大的卵母細(xì)胞要晚。而在本實(shí)驗(yàn)中，性逆轉(zhuǎn)過程中首先消失的是體積較大的卵母細(xì)胞的信號(hào)，最后才是初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞消失，卵母細(xì)胞凋亡完成的時(shí)序與劉修業(yè)描述的卵母細(xì)胞凋亡順序一致。黃鱔Caspase-3的這種表達(dá)模式與其它物種存在較大的差異，這可能與黃鱔為分批產(chǎn)卵方式和產(chǎn)卵后進(jìn)入性腺性逆轉(zhuǎn)過程的特性有密切關(guān)系。