■陳雙雙 司華哲 蔡熙姮 張如春 張新宇 史鴻鵬 李光玉 劉晗璐*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春130112; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118）

藍(lán)狐（Alopex lagopus），食肉目，犬科，是我國飼養(yǎng)的主要裘皮動物之一。藍(lán)狐腸道較短，僅為體長的3.5～4 倍，食物在腸道中停留時(shí)間短，排空速度快[1]。隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展，目前在藍(lán)狐繁殖育種、疾病防控、營養(yǎng)需要量、毛皮發(fā)育等方面開展了大量的研究[2-5]，但對于藍(lán)狐的腸道微生態(tài)系統(tǒng)及功能的研究較少。腸道微生物區(qū)系作為動物體最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，被稱為動物重要的代謝“器官”，參與機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收及能量代謝過程，而且參與機(jī)體的免疫過程，并對動物健康具有重要影響[6-9]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，河北昌黎地區(qū)雄性藍(lán)狐糞便微生物中以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門為主，其中厚壁菌門含量最高。在屬水平上以鏈球菌屬、乳桿菌屬、普雷沃菌屬、巨型球菌屬、柯林斯菌屬為主[10]。但對于飼養(yǎng)條件下藍(lán)狐腸道微生物的組成與分類仍未得到充分研究，此外關(guān)于藍(lán)狐腸道菌群與宿主營養(yǎng)物質(zhì)利用的研究也很缺乏，本研究作為藍(lán)狐腸道菌群組成及功能研究的一部分，運(yùn)用高通量測序及數(shù)據(jù)分析技術(shù)，研究藍(lán)狐腸道菌群的組成，為未來藍(lán)狐營養(yǎng)物質(zhì)利用乃至日糧調(diào)配提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018 年8 月從吉林地區(qū)的農(nóng)業(yè)部長白山野生生物資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測試驗(yàn)站隨機(jī)選取6 只健康（精神狀態(tài)正常、采食均衡、生活環(huán)境良好）的育成期（3～4月齡）雌性舍飼藍(lán)狐（J1～J6），對其心臟注射5 ml的琥珀乙酰膽堿處死后，立即取結(jié)腸后段內(nèi)容物?，F(xiàn)場采集15 g藍(lán)狐結(jié)腸后端內(nèi)容物，立即用無菌分裝袋收集分裝于5 ml的凍存管中（分裝于3個(gè)管，每管5 g），放入液氮罐中速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室，備后續(xù)分析。藍(lán)狐飼糧為養(yǎng)殖場中日常飼糧，日糧組成及營養(yǎng)水平滿足育成期藍(lán)狐營養(yǎng)需要，如表1所示。

表1 藍(lán)狐飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.2 樣品處理

1.2.1 細(xì)菌總DNA的提取及測序

對藍(lán)狐結(jié)腸食糜樣品中細(xì)菌基因組DNA的提取按照Fast DNASPIN as Kit for Feces 說明書進(jìn)行[10]。提取的基因組DNA 經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，電泳23 min，Marker 為λⅢDNA Maker）檢測，DNA 產(chǎn)物在14 000 bp 左右。將目的DNA 送至北京諾禾致源科技股份有限公司，基于IonS5TMXL測序平臺，利用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對目的基因的V3～V4 區(qū)進(jìn)行單端測序（Single-End），利用單端測序的方法構(gòu)建小片段文庫。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

使 用Cutadapt（V1.9.1,http：//cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）先對reads 進(jìn)行拼接、過濾去雜得到有效信息有效數(shù)據(jù)（Clean Reads）。利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/uparse/)Clean Reads 進(jìn)行聚類，設(shè)定具有97%以上相似度的序列為1 個(gè)操作分類單元（OTU），對OTUs 序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132（http：//www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，并在各分類水平下統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基中藍(lán)狐糞便菌群組成。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Alpha指數(shù)和Beta 指數(shù)，并用R 軟件（Version 2.15.3）對不同培養(yǎng)液中的細(xì)菌組成進(jìn)行組間差異性分析以及組間差異物種分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 2013進(jìn)行整理并用SAS 9.4軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性指數(shù)分析

本研究基于高通量測序技術(shù)對6 只健康藍(lán)狐結(jié)腸菌群的16S rDNA 的V3～V4 區(qū)進(jìn)行測序。6 個(gè)樣品共獲得377 798 條有效序列，平均為62 966 條有效序列，其中J1 的有效序列數(shù)最少為46 921 條，J6的有效序列數(shù)最多為80 249 條。在97%相似度下進(jìn)行聚類分析，共獲得2 064 個(gè)OTU，平均為307 個(gè)OTU。

Alpha 多樣性指數(shù)分析表明，藍(lán)狐結(jié)腸菌群物種具有較高的多樣性和豐度。如表2 所示，其中Ace 指數(shù)（范圍為216～416，均值312）和Chao1 指數(shù)（范圍為201～393，均值296）為菌群物種豐度指數(shù)，Shannon指數(shù)（范圍為2.30～5.37，均值4.31）和Simpson 指數(shù)（范圍為0.649～0.953，均值0.869）為菌群物種多樣性指數(shù)。

表2 樣本測序數(shù)據(jù)分析

圖1 稀釋曲線（A）和等級聚類曲線（B）

如圖1(A)所示，當(dāng)測序數(shù)量超過25 000 時(shí)，各樣本曲線逐漸趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種。等級聚類曲線（Rank Abundance）作為常見的描述組內(nèi)樣本多樣性的曲線，可直觀的反映樣本中物種的豐富度和均勻度[11]。如圖1(B)所示，隨著測序的深入，在水平方向上，曲線在橫軸上的跨度較大，物種的豐富度高；在垂直方向上，曲線趨于平緩，因此物種分布均勻。

2.2 門分類水平下菌群結(jié)構(gòu)分析

圖2可見，在門分類水平上分析，6個(gè)樣本獲得的所有菌群歸類于12 個(gè)門，主要集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria），含量均在1%以上，其中厚壁菌門為最優(yōu)勢菌門。厚壁菌門平均含量為70.25%，擬桿菌門平均含量為22.36%，變形菌門平均含量為5.69%，放線菌門平均含量為1.13%，4 個(gè)菌門共占99.43%。

圖2 藍(lán)狐腸道菌群門分類的相對豐度

2.3 屬分類水平下菌群結(jié)構(gòu)分析

在屬分類水平上分析，6 個(gè)樣本獲得的所有菌群歸類于180 個(gè)菌屬，圖3 為前30 的菌屬的相對豐度圖，表3 為前10 的菌屬所占比例。菌屬中比例大于1%共有15 個(gè)，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）為最優(yōu)勢菌屬，平均含量為28.50%；其次為巨單胞菌屬（Megamonas），平均含量為7.48%；隨后依次為擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)占7.41%；Peptoclostridium占6.33%；乳球菌屬（Lactococcus）占5.38%；Dialister占4.39%；巨型球菌屬（Megasphaera）占3.53%；Desulfovibrio 占2.97% ；擬 桿 菌 屬（Bacteroides）占2.48%；unidentified_Lachnospiraceae占2.38%，前10個(gè)菌屬共占70.85%。具體屬分類水平的相對豐度見圖3。

圖3 藍(lán)狐腸道菌群屬分類的相對豐度

3 討論

藍(lán)狐作為食肉動物，對高蛋白質(zhì)、高脂肪的動物性飼料有較高的利用率[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)狐可耐受脂肪比例高達(dá)44%的日糧，而未見任何生理異常[13]，該現(xiàn)象是否與藍(lán)狐腸道微生物存在聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究。因此，本試驗(yàn)利用高通量測序技術(shù)，對藍(lán)狐結(jié)腸菌群的組成與多樣性進(jìn)行分析。

3.1 多樣性指數(shù)分析

Alpha 指數(shù)用于分析樣本菌群多樣性，反映樣本中細(xì)菌的多樣性和豐度[14]。Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)反映菌群中物種豐度，其值越高則菌群中物種豐度越高；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映菌群中物種多樣性，其值越高則菌群中物種多樣性越豐富[11]。覆蓋率（Coverage）代表樣品微生物群落被測出的概率[15]。如表2 顯示，本試驗(yàn)樣品測序覆蓋率都在0.997 以上，說明本試驗(yàn)樣品測試結(jié)果真實(shí)可靠。如圖1 所示，隨著測序數(shù)量的增加稀釋曲線趨于平坦，則說明隨著測序深度的增加幾乎不產(chǎn)生新的OTU。本試驗(yàn)中OTU 均值為307，Ace 指數(shù)均值為311，Shannon 指數(shù)均值為4.31。本團(tuán)隊(duì)前期對河北昌黎地區(qū)的雄性藍(lán)狐糞便中菌群進(jìn)行了高通量測序分析，OTU 均值為509，Ace 指數(shù)均值為559，Shannon 指數(shù)均值為5.27[10]。與河北地區(qū)藍(lán)狐腸道菌群相比，藍(lán)狐腸道菌群中具有較低的物種豐度與多樣性，這中差異可能來自地域、日糧組成、年齡、性別以及測序方式帶來的差異。表1 所示，藍(lán)狐J5、J6 的Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)較高為401、416 和393、386，則表明J5和J6兩只藍(lán)狐結(jié)腸微生物中具有較高的豐度。J3的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)最低，則J3 結(jié)腸中微生物群落的多樣性最低。通過Alpha 指數(shù)分析表明，與其它藍(lán)狐相比，藍(lán)狐J3 結(jié)腸中菌群具有較低的豐度和多樣性，其原因可能與動物個(gè)體的生理狀態(tài)和遺傳因素有關(guān)。

表3 藍(lán)狐腸道不同菌屬所占比例(%)

3.2 菌群結(jié)構(gòu)與物種豐度分析

從門分類水平分析，藍(lán)狐結(jié)腸前五的優(yōu)勢菌門為Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria、梭桿菌門（Fusobacteria），與狼、豺、家犬等犬科動物腸道菌群研究結(jié)果一致[16-19]。6 只藍(lán)狐中J3、J6結(jié)腸中最優(yōu)勢菌門Firmicutes 所占比例高達(dá)98.17%、89.02%。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes 與脂肪、蛋白質(zhì)的消化有關(guān)，藍(lán)狐作為以高蛋白質(zhì)、高脂肪的動物性飼料為食的肉食動物，因此，F(xiàn)irmicutes 有促進(jìn)日糧營養(yǎng)消化吸收的作用[20-22]。研究表明，Bacteroidetes 與類固醇、膽汁酸、糖類代謝有關(guān)，對多糖的吸收和蛋白質(zhì)的合成具有促進(jìn)作用[23]。大量研究發(fā)現(xiàn)，在動物腸道中Firmicute s 和Bacteroidetes 的比例與動物個(gè)體的肥胖程度有關(guān)，肥胖個(gè)體腸道中Firmicutes 的比例升高、Bacteroidetes 的比例下降，當(dāng)動物腸道中Firmicutes 豐富度增加，Bacteroidetes 豐富度降低時(shí)，發(fā)現(xiàn)飲食過程中動物體對能量的攝入量增多[23-25]。因此，藍(lán)狐J3、J6 個(gè)體對脂肪和蛋白質(zhì)等具有較強(qiáng)的吸收能力，但本試驗(yàn)并未對藍(lán)狐體重水平進(jìn)行觀察。藍(lán)狐、水貂同為我國主要的毛皮動物，研究表明，水貂結(jié)腸菌群中較豐富的5 個(gè)菌門為Firmicutes(60.0%)、Bacteroidetes(16.2%)、Fusobacteria（11.5%）、Actinobacteria（5.9%）和Proteobacteria(5.3%)[26]。與藍(lán)狐結(jié)腸菌群相比，水貂結(jié)腸菌群中Fusobacteria 所占比例較高，其它菌門種類與藍(lán)狐結(jié)腸菌門類似。研究發(fā)現(xiàn)，在動物腸道中Fusobacteria 所占比例與動物飼糧中纖維含量有關(guān)，當(dāng)飼糧中纖維含量較少時(shí)，F(xiàn)usobacteria 所占比例增加[27]。與水貂飼糧相比，藍(lán)狐飼糧中纖維含量較高，因此可能導(dǎo)致藍(lán)狐結(jié)腸菌群中Fusobacteria所占比例較低。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，草食動物馬的腸道菌群中沒有發(fā)現(xiàn)Fusobacteria細(xì)菌的存在[28]；而人腸道菌群中Fusobacteria 所占比例不足1%[29]。因此，動物腸道中Fusobacteria 所占比例可能受飼糧中植物性飼料組成的影響。

從屬分類水平分析，藍(lán)狐結(jié)腸菌群中優(yōu)勢菌屬為Lactobacillus、Megamonas、Alloprevotella、Peptoclostridium、Lactococcus、Dialister、Megasphaera、Desulfovibrio、Bacteroides、unidentified_Lachnospiraceae，而藍(lán)狐糞便菌群中的優(yōu)勢菌屬為Streptococcus、Lactobacillus、Prevotella、Megasphaera、Collinsella、Blautia、Bacteroides、Alloprevotella、Peptoclostridium、Megamonas，與藍(lán)狐糞便菌群結(jié)果存在差異性，其原因可能與藍(lán)狐地域、品種、年齡、性別等有關(guān)系[30-32]。Lactobacillus 屬于Firmicutes，其作為益生菌受到人們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在動物體中，Lactobacillus存在于動物體的許多部位，如消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，構(gòu)成微生物群的重要組成部分[33]。在動物腸道中Lactobacillus代謝物丁酸鈉以及有機(jī)酸等的存在，引起腸道內(nèi)環(huán)境pH 值的降低，抑制有害菌的生長；Lactobacillus 能產(chǎn)生過氧化氫，在體外和體內(nèi)抑制白色念珠菌的生長和毒力，并通過減少白念珠菌生物膜的形成來降低其致病性[34]。體外研究也表明，Lactobacillus 通過產(chǎn)生有機(jī)酸和某些代謝物來降低白色念珠菌的致病性[35]。研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus 與其他益生菌聯(lián)合使用可幫助治療腸易激綜合癥(IBS)，當(dāng)腸道微生物群中條件致病菌含量過高時(shí)，益生菌可以恢復(fù)體內(nèi)微生物菌群的平衡[36-37]。此外，Lactobacillus作為益生菌還可治療由潰瘍引起的幽門螺桿菌感染[38]。Lactococcus 原屬于Streptococcus的N1群的一種菌屬，其唯一產(chǎn)物乳酸可調(diào)節(jié)環(huán)境條件pH值，從而阻止腐敗細(xì)菌的生長，但國內(nèi)外鮮有報(bào)道[39-40]。Bacteroides在動物腸道中主要參與動物蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪的代謝，當(dāng)日糧中蛋白質(zhì)和動物脂肪含量高時(shí)會使Bacteroides 比例提高[41]。與河北昌黎地區(qū)藍(lán)狐相比，吉林左家地區(qū)藍(lán)狐結(jié)腸菌群中Prevotella、Blautia含量減少。研究發(fā)現(xiàn)，Prevotella主要參與植物蛋白質(zhì)的代謝，同時(shí)在瘤胃中還具有分解纖維素的能力[42]；Blautia在瘤胃中主要具有降解半纖維素的能力[43]，兩種菌屬的比例與動物的日糧有關(guān)，當(dāng)日糧中纖維素水平增加時(shí)，該類菌群含量增加，但該類細(xì)菌在藍(lán)狐腸道中的作用仍有待進(jìn)一步研究確定。與河北昌黎地區(qū)藍(lán)狐糞便菌群組成相比，吉林左家地區(qū)藍(lán)狐結(jié)腸菌群組成存在差異性的原因除飼養(yǎng)環(huán)境、品種和研究方法不同外，也可能是飼糧配方不同造成的[44]。屬水平上個(gè)體間差異性分析顯示，J3結(jié)腸菌群中Peptoclostridium所占比例較高，其它菌屬所占比例較低；J2 和J4 結(jié)腸菌群中Lactobacillus 所占比例較低，同時(shí)J2結(jié)腸菌群中Alloprevotella所占比例較高。研究發(fā)現(xiàn)在生活環(huán)境、性別、年齡、飼糧水平相同的情況下，動物腸道菌群組成和多樣性還受到動物的遺傳因素的影響[33]。因此，即使在相同環(huán)境下的不同個(gè)體間腸道中的微生物群落的組成和多樣性也可能存在一定的差異性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)飼糧條件下的6 只藍(lán)狐結(jié)腸菌群分布于12 個(gè)菌門，主要為Firmicutes（70.25%）、Bacteroidetes(22.36%)、Proteobacteria(5.69%)、Actinobacteria(1.13%)，4個(gè)菌門共占99.43%；所有菌門分布于180個(gè)菌屬，組成豐富多樣化的腸道菌群，在屬的分類水平上Lactobacillus所占比例最高，為28.50%；其次為Megamonas，占7.48%。