■李生杰 趙國先 劉彥慈 馬可為 郝艷霜 劉觀忠 馮志華*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北保定071000）

白藜蘆醇（Resveratrol，Res），一種稱為反式3,5- 4，三羥基雙苯乙烯的化學(xué)物質(zhì)，當植物受到某些細菌的感染或者是處于惡化的環(huán)境中時，能夠產(chǎn)生這種天然多酚類的物質(zhì)，為一種抗毒素，具有保健和多種重要的生物學(xué)功能。天然存在于多種植物或水果，如葡萄、松樹、花生和決明子。Res具有抗氧化、防腐、抗腫瘤的作用[1]，另外還能治療炎癥、心臟病，能發(fā)揮一定作用，并且還能調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，使其恢復(fù)正常平衡狀態(tài)[2]。近年來，食品添加劑、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)研究生物活性物質(zhì)對身體健康有益的生物藥理作用，使一些生物活性物質(zhì)得到廣泛使用。在畜禽養(yǎng)殖中，有研究表明，雞肉和豬肉的品質(zhì)以及肉雞的免疫功能都會因為有機物的添加而提高，但是在蛋雞方面的研究未見報道。本試驗旨在研究日糧中添加不同量的Res 對產(chǎn)蛋后期蛋雞抗氧化能力和相關(guān)基因表達有何影響，并初步探究其分子機理，為綠色飼料添加劑的研發(fā)提供理論依據(jù)，促進蛋雞產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Res（純度≥50%，上海諾特生物科技公司提供）。

1.2 試驗設(shè)計與試驗日糧

試驗采用單因子完全隨機區(qū)組設(shè)計，挑選360只60 周齡健康無病且體重和產(chǎn)蛋率相近的京粉1 號蛋雞，隨機分成5 組，每組6 個重復(fù)，每個重復(fù)有12 只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧（基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表1）。試驗組在基礎(chǔ)日糧上分別添加0.05%、0.10%、0.20%、0.40%量的Res?；A(chǔ)飼糧在參照NRC（1994）和中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T33—2004 的基礎(chǔ)上，結(jié)合京粉1 號蛋雞飼養(yǎng)管理手冊配制。預(yù)試期1周，試驗期為8周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

半開式3層實心籠，上、中、下三排梯籠架平均分布。利用天然和人工兩種補光方式，保持其強度為14 LX 且每天要有16 h 光照。自由采食，喂干粉，于每天上午8：30 和下午14：00 各喂1 次，采用乳頭式飲水。安排專人負責(zé)防疫程序，每天撿蛋一次，每周進行一次雞糞清理。每天注意察看雞的精神狀態(tài)，及時清除死雞并記錄數(shù)量。

1.4 樣品采集

在試驗結(jié)束時最后1 d時，每個重復(fù)選2只蛋雞，每組共選12只，總共60只。首先對其禁食供水，12 h之后于頸靜脈進行采血，將所采血液靜置至有部分血清析出之后，再將其在3 500 r/min條件下離心10 min，最后收集血清分裝保存于-20 ℃，待測血清抗氧化指標。將所選雞只屠宰，在頸靜脈進行放血，去毛之后在右側(cè)肝臟和胸肌同一部位取樣，并用生理鹽水沖洗樣品表面血漬，之后用5 ml離心管盛放且立即放入液氮中進行冷凍一段時間，最后放置于-20 ℃保存留用，用以測定抗氧化酶酶活活性；另外在左側(cè)肝葉中部位置切取兩塊筋膜較少的組織，分裝于兩個1.5 ml無RNA 酶的EP 管中，迅速投入液氮（開膛后2 min內(nèi)），然后放置于-80 ℃冰箱中保存，分子樣品在1 個月內(nèi)檢測。

1.5 抗氧化指標的測定

1.5.1 肝臟抗氧化酶活性的測定

試劑的配制和試驗操作均按說明書進行，測定的指標包括總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性均用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

1.5.2 肝臟中抗氧化酶mRNA相對表達量的測定

1.5.2.1 總RNA提取

從肝臟中提取總RNA，并使用電泳檢測RNA的完整性。電泳檢測-RNA 電泳結(jié)果(1.5%瓊脂糖，1×TAE 電泳緩沖液，紫外透射光下察看并拍照)(見圖1)。

1.5.2.2 反轉(zhuǎn)錄

實驗試劑為第一鏈cDNA 合成試劑盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit）(SK2445)，cDNA 第一鏈合成依照說明書操作。將上述模板cDNA 分裝到若干小管中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2.3 肝臟PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD基因的引物設(shè)計與合成

PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 基因的引物設(shè)計見表2，上海生物工程技術(shù)公司提供合成的引物。

圖1 蛋雞肝臟總RNA 凝膠電泳圖

1.5.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測

試驗樣本：該cDNA 樣本在機器上被稀釋為模板的8倍。

實時定量PCR 試劑：ABI SybrGreen PCR Master Mix（2X）。

定 量PCR 儀：LightCycler480 Software Setup(Roche 羅氏)。

PCR反應(yīng)步驟：

①配制反應(yīng)混合液10 μl SybrGreen qPCR Master Mix（2X），1 μl引物F(10 μM)，1 μl引物R(10 μM)，6 μl dd H2O，2 μl Template (cDNA)。

②PCR 循環(huán)條件：95 ℃3 min，95 ℃15 s，60 ℃40 s，進行40個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

以重復(fù)為單位，使用SAS 8.0 軟件進行試驗數(shù)據(jù)的分析，使用One-way ANOVA進行方差分析，并進行一次線性回歸分析。鄧肯法用于顯著性差異的多重比較。結(jié)果以“X±標準差SD”表示。

表2 目的基因及內(nèi)參Real-time PCR 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 對肝臟抗氧化酶活性的影響

日糧中添加Res 對蛋雞肝臟抗氧化指標的影響見表3。由表3 可見，蛋雞日糧中添加不同水平的白藜蘆醇對其肝臟中MDA 活性均無顯著影響（P＞0.05）。隨著Res 添加水平的提高，蛋雞肝臟T-AOC、T-SOD 和GSH-Px 的活性顯著增加（P＜0.01），且與Res添加量之間呈線性相關(guān)（P＜0.01）。

表3 Res對蛋雞肝臟抗氧化指標的影響

2.2 對肝臟中抗氧化酶mRNA相對表達量的影響

日糧中添加Res 對蛋雞肝臟PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA 表達的影響見表4。由表4可見，日糧中添加不同水平的白藜蘆醇對蛋雞肝臟中PGC-1α和Nrf2 mRNA 的表達量均無顯著影響（P＞0.05）。隨著Res添加水平的升高，蛋雞肝臟Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA表達量均呈顯著線性增加（P＜0.01），0.20%組、0.40%組Mn-SOD 的mRNA 表達量較對照組極顯著提高（P＜0.01），但兩組間無顯著性差異（P＞0.05）。0.10%、0.20%組和0.40%組Cu/Zn-SOD 的mRNA 表達量對照組極顯著提高（P＜0.01），三組間無顯著性差異（P＞0.05）。

表4 Res對蛋雞肝臟PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA表達的影響

3 討論

3.1 Res對產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟抗氧化指標的影響

現(xiàn)代規(guī)?；?、集約化生產(chǎn)條件下，產(chǎn)蛋雞易受到生產(chǎn)過程中的免疫接種、飼養(yǎng)密度、熱或冷應(yīng)激、圈舍氨氣及驚嚇等因素的影響，導(dǎo)致蛋雞機體的氧化還原平衡狀態(tài)受到破壞而發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)造成抵抗力下降，生產(chǎn)性能降低，影響生產(chǎn)效益。隨著產(chǎn)蛋雞進入產(chǎn)蛋后期，其身體機能各項指標都有所下降，如果雞只飼養(yǎng)密度過高以及長期排卵，這時候容易引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。隨著雞的日齡增加，其體內(nèi)的一些抗氧化酶活性下降，導(dǎo)致其氧化/抗氧化平衡系統(tǒng)發(fā)生紊亂，機體不能及時清除掉自由基，導(dǎo)致自由基的數(shù)量有所增加，代謝紊亂、組織器官功能下降、細胞功能的退化均和自由基的數(shù)量增多有關(guān)，影響蛋雞健康和產(chǎn)蛋性能。

總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）可以反映機體的抗氧化能力。抗氧化功能綜合評價指標使用總抗氧化能力（T-AOC），機體自由基代謝的情況以及受到環(huán)境刺激時其代償能力情況都可用總抗氧化能力大小來反映。GSH-Px在還原型谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷墓入赘孰?GSSG)方面發(fā)揮重要作用，機體中的過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物也可被其清除掉，達到保護機體的目的。超氧化物歧化酶具有非常重要的作用，可以防止發(fā)生一些生理病變，使機體內(nèi)的氧自由基保持在一定的數(shù)量，能夠清除體內(nèi)的超氧陰離子，并且可以和超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過氧化氫，被認為是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線。例如，當身體處于病理或者衰老狀態(tài)時，由于SOD 的突然降低而引起的自由基急劇增加。脂質(zhì)過氧化物的含量水平可以由MDA含量的大小來間接反反映，因為是脂質(zhì)過氧化物所氧化形成的最終產(chǎn)物，說明活性氧（ROS）自由基攻擊對機體脂質(zhì)有損傷作用。本試驗結(jié)果顯示，肝臟中T-AOC、T-SOD 和GSH-Px的活性亦隨著白藜蘆醇水平的升高而顯著增加。提示白藜蘆醇增強機體抗氧化功能的機理是提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。與本結(jié)果類似，周玲芝[3]報道，急性酒精肝損傷小鼠血清與肝組織SOD、GSH-Px活力會因白蘆藜醇添加而升高，血清與肝組織MDA含量會隨著白蘆藜醇的添加而下降。張彩云等[4]報道，0.10%白藜蘆醇可顯著提高血清T-AOC 水平，顯著降低血清MDA 水平，0.20%白藜蘆醇能顯著提高T-SOD活性及其在肉雞肝臟T-AOC水平，顯著降低肝組織MDA含量；Sridhar等[5]研究報道，在肉仔雞日糧中添加白藜蘆醇可以提高其抗氧化水平，并有效抵御AFB1-誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)。竇健霖等[6]報道白藜蘆醇可增加血清抗氧化酶GSH-PX、GST、CAT、T-SOD、GSH 活性，降低MDA 含量，這一作用呈一定的量效關(guān)系。另有研究表明，白藜蘆醇可使鵪鶉血清中MDA含量呈線性下降；肝臟中SOD[7]、CAT和、GSH-Px 活性以及Nrf2 的表達成線性增加[8]。Baxter[9]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇阻止自由基或脂質(zhì)（peroxidation)氧化的生物學(xué)效率是95%，而傳統(tǒng)的抗氧化劑如VE和VC分別是65%和37%。Zhu 等[10]報道，在大鼠日糧中添加白藜蘆醇可以降低血清MDA 濃度，同時增加肝組織的谷胱甘肽含量和GPx 活性以及血清SOD 水平。Zhang 等[11]報道，育肥豬日糧中添加白藜蘆醇可以提高肌肉中T-AOC、GPx 活性和GPx mRNA 水平，提示其抗氧化能力的增強。

3.2 Res對產(chǎn)蛋雞肝臟Nrf2、PGC-1α、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA水平的影響

調(diào)控抗氧化酶基因表達的主要核轉(zhuǎn)錄因子為Nrf2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2），被激活進入細胞核與抗氧化酶作用元件結(jié)合后調(diào)控抗氧化酶的基因表達。PGC-1α 作為一種具有多重功能的輔因子，除了在能量代謝中具有重要作用外[12]，還可通過GSH-Px 和SOD 等抗氧化酶有效調(diào)控活性氧代謝[13]。Wu 等[14]報道，PGC-1α可通過刺激核呼吸因子Nrf2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控與ARE調(diào)節(jié)有關(guān)的抗氧化酶的基因表達[15]來誘導(dǎo)SOD 和GSH-Px 等酶的產(chǎn)生[16]。在當前研究中，白藜蘆醇對蛋雞肝臟中PGC-1α和Nrf2 mRNA 的表達量均無顯著影響（P＞0.05），但有升高的趨勢，這說明白藜蘆醇可能在一定程度上激活PGC-1α-Nrf2-ARE-抗氧化酶反應(yīng)通路增加相關(guān)抗氧化酶的mRNA表達。

SOD是一種金屬酶，其所包含的蛋白質(zhì)部分和結(jié)合到蛋白活性部位的金屬離子都能夠影響它的酶活性和理化性質(zhì)。按其所含金屬輔基的不同，將其劃分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/ZnSOD、Ni-SOD、Mn/FeSOD和Fe/ZnSOD 六種不同的酶，目前研究較多的兩種酶為Cu/ZnSOD 和Mn-SOD。原核生物和真核生物甲殼動物的線粒體中含有大量的錳超氧化物歧化酶，細胞質(zhì)中也含有少量的這種酶；Cu/ZnSOD 廣泛存在于細胞中，其含量占到總SOD 的90%，其作用是維持氧自由基的平衡、清除轉(zhuǎn)移超氧陰離子自由基、集體防御氧化損傷，是一種重要的金屬酶。在本研究中，日糧中添加適宜水平的白藜蘆醇可使蛋雞肝臟Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA表達量顯著增加，與本試驗肝臟和血清中T-SOD 和GSH-Px 等抗氧化酶的活性增加的結(jié)果是一致的?？寡趸富虮磉_量的增加可以促進酶活的提高，因此，白藜蘆醇可能以增加Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 表達的方式發(fā)揮其抗氧化作用，其詳細機制還需進一步深入研究。

4 結(jié)論

本試驗的研究結(jié)果顯示，飼糧中添加適量白藜蘆醇可以增強蛋雞血清中谷胱甘肽過氧化物酶和總超氧化物歧化酶的活性，使血清丙二醛含量下降；隨著白藜蘆醇水平的升高，肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶、總超氧化物歧化酶的活性和總抗氧化能力會相應(yīng)增強，肝臟中的Mn-SOD和Cu/Zn-SOD酶的mRNA表達量也會上升。由此可見，白藜蘆醇可能是通過調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達和活性變化發(fā)揮抗氧化作用，但其具體作用機理仍需要進一步研究。