薛揚 劉娜 張苗怡 唐杰 付建輝

腦小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)指各種致病因素累及顱內(nèi)小動脈、小靜脈、微動脈、微靜脈和毛細血管所導致的一組臨床疾病[1]，其中以小動脈硬化型最常見[2]。目前對CSVD發(fā)病機制尚未明了。有研究表明，腦室周圍靜脈膠原沉積與CSVD中的腦白質損害及微梗死有關[3-5]，可能機制包括靜脈膠原沉積導致的靜脈管腔狹窄、血循環(huán)壓力增加，血灌注下降，血-腦屏障損害，繼而引起慢性缺血、血管源性水腫等[3，6-7]。流行病學資料表明，高血壓是小動脈硬化型CSVD最主要的危險因素之一[8]。以往的研究多集中于高血壓對小動脈的影響，針對小靜脈的病理改變研究較少[9]。本研究擬采用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)模型，探討高血壓對小動脈硬化型CSVD腦小靜脈管壁基質表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：10周齡雄性SHR(高鹽飲食SHR組)及雄性Wistar Kyoto(Wistar Kyoto rat，WKY)大鼠(WKY組)，各6只，來源于維通利華實驗動物公司，給予SHR 10個月高鹽飲食(1%氯化鈉飲用水及4%高鹽飼料)，給予WKY大鼠10個月正常飲用水及飼料。大鼠均飼養(yǎng)于復旦大學附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所，恒溫22～24℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12h。SHR大鼠體質量為360～400g，WKY大鼠體質量為380～440g，大鼠合格證號為SCXK(京)2016-0006。

1.1.2主要儀器及試劑：冰凍切片機(CM3050 S，萊卡，德國)、正置熒光顯微鏡(BX53，奧林巴斯，日本)；一抗包括兔源抗α-平滑肌細胞肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(1∶500，Sigma，日本)、小鼠來源抗Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ，COLⅠ)抗體(1∶1 000，Abcam，英國)、小鼠來源抗Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ，COLⅣ)抗體(1∶1 000，Abcam，英國)、小鼠來源抗纖連蛋白抗體(1∶1 000，Abcam，英國)、小鼠來源抗層黏連蛋白(laminin，LN)抗體(1∶1 000，Abcam，英國)等；熒光標記二抗包括Alexa Fluor?488標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000，Invitrogen，美國)、Alexa Fluor?555標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，Invitrogen，美國) 等。

1.2 實驗方法

1.2.1組織處理：以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，依次經(jīng)心臟灌注等滲鹽水、4%多聚甲醛，斷頭取腦，腦組織固定于4℃ 4%多聚甲醛中過夜。一半腦組織用于石蠟切片，一半用于冰凍切片，切片選擇層面為前囟前3.0mm(Bregma+3.0mm)，前囟后0.24mm(Bregma-0.24mm)和前囟后3.0mm(Bregma-3.0mm)。參考Bailey等[10]研究方法將腦組織劃分為皮質、深部灰質、海馬，并進行觀察統(tǒng)計分析。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色：取5μm石蠟切片按標準流程進行HE染色[11]，觀察小血管形態(tài)變化。

1.2.3免疫熒光檢測靜脈膠原沉積：將熒光顯微鏡下α-SMA表達連續(xù)的視為小動脈，α-SMA不表達或表達不連續(xù)的視為小靜脈。評估的小靜脈直徑為20～100μm，除外毛細血管(5μm)及直徑<20μm的難以檢測的血管。

取冰凍切片，0.25%聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)破膜15min，5%牛血清白蛋白室溫封閉1h，抗α-SMA抗體分別與抗COL Ⅰ 抗體、抗COLⅣ抗體、抗纖連蛋白抗體、抗LN抗體混合后4℃孵育切片過夜，隨后相應二抗混合后室溫下孵育1h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，熒光顯微鏡下觀察。每個層面的每個腦區(qū)隨機拍攝3～5個視野。使用Image-J軟件(V1.48，National Institutes of Health，美國)進行圖像分析。以拍攝圖片的平均熒光強度量化腦小靜脈膠原沉積及各細胞外基質表達的多少。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HE染色血管形態(tài)學變化

由于飼養(yǎng)時間較長，高鹽飲食SHR組和WKY組均出現(xiàn)2只死亡，實驗終點2組動物均為4只。HE染色可見，高鹽飲食SHR小動脈血管重構，管壁增厚，內(nèi)徑減小，伴隨血管周圍間隙增大，符合小動脈硬化型CSVD的病理特點(圖1)。

2.2 高鹽飲食SHR與WKY大鼠腦小靜脈膠原沉積及相關細胞外基質表達情況整體比較

與WKY組比較，高鹽飲食SHR組腦小靜脈周圍有顯著增加的COL Ⅰ 沉積及LN表達(均P<0.05；圖2，3，表1)；而腦小靜脈周圍COLⅣ及纖連蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05；圖4，5，表1)。

表1 高鹽飲食SHR與WKY大鼠腦小靜脈膠原沉積與相關細胞外基質表達水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠；COLⅠ為Ⅰ型膠原蛋白，COLⅣ為Ⅳ型膠原蛋白， LN為層黏連蛋白

2.3 兩組不同腦區(qū)膠原沉積及細胞外基質表達比較

2.3.1不同腦區(qū)腦小靜脈COLⅠ沉積比較：與WKY組比較，高鹽飲食SHR組腦皮質及深部灰質小靜脈COLⅠ沉積顯著增加(均P<0.01)，而海馬區(qū)表達組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈Ⅰ型膠原蛋白沉積水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

2.3.2不同腦區(qū)腦小靜脈COL Ⅳ 沉積比較：高鹽飲食SHR組和WKY組腦皮質、深部灰質及海馬的小靜脈COL Ⅳ 沉積差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05，表3)。

表3 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈Ⅳ型膠原蛋白沉積水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

2.3.3不同腦區(qū)腦小靜脈纖連蛋白表達水平比較：與WKY組比較，高鹽飲食SHR組各腦區(qū)的腦小靜脈纖連蛋白沉積差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05，表4 )

2.3.4不同腦區(qū)腦小靜脈LN表達水平比較：與WKY組比較，高鹽飲食SHR深部灰質小靜脈LN表達顯著增加(P=0.002)，皮質和海馬區(qū)小靜脈LN表達差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05，表5)。

表4 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈纖連蛋白表達水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

表5 高鹽飲食SHR與WKY大鼠各腦區(qū)腦小靜脈層黏連蛋白表達水平比較

注：SHR為自發(fā)性高血壓大鼠，WKY為Wistar Kyoto大鼠

3 討論

在以高血壓為主要危險因素的小動脈硬化性CSVD中，腦小動脈存在管壁增厚、管壁基質增生、血管內(nèi)徑減小等重構變化，高血壓在小動脈重構中起重要作用[12]。為模擬長期慢性高血壓并加劇SHR大鼠血管重構改變，本實驗對SHR大鼠給予了長達10個月的高鹽飲食飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)配合高鹽飲食的高血壓大鼠不僅表現(xiàn)小動脈重構，其腦小靜脈管壁基質也明顯增生。

腦靜脈血管壁基質沉積增加最早見于Moody等[3]的報道，他們通過對22例不同年齡死者的尸檢，發(fā)現(xiàn)65%的60歲以上患者存在腦室周圍靜脈膠原沉積，因而提出“腦室周圍靜脈膠原病”一詞。Brown等[5]研究發(fā)現(xiàn)，人腦室周圍靜脈膠原沉積的主要成分是COLⅠ和COLⅢ，而Lin等[4]在雙腎雙夾合并雙側頸動脈狹窄大鼠中發(fā)現(xiàn)，腦小靜脈膠原沉積以COLⅠ和COLⅣ為主。本研究結果表明，高鹽飲食SHR大鼠腦小靜脈血管壁COL Ⅰ 較WKY組明顯增生，COL Ⅳ與WKY組間差異無統(tǒng)計學意義，與Lin等[4]報道基本一致。高血壓導致的小動脈血管壁基質增生，不僅表現(xiàn)在膠原增生，還伴隨LN及纖連蛋白等其他血管壁基質的改變，并且有報道指出，LN及纖連蛋白可能在血管壁膠原持續(xù)表達中起到穩(wěn)定作用[13-14]。因此，本研究同時還檢測了腦小靜脈壁LN及纖連蛋白表達情況，其中高鹽飲食SHR大鼠腦小靜脈LN明顯增生。有研究提示，LN可能參與高血壓帶來的血流剪切力變化對內(nèi)皮細胞的影響，高鹽飲食SHR大鼠腦小靜脈LN增生可能進一步提示，血流動力學變化在腦小靜脈基質增生中可能起到重要作用[15]。

目前對于腦靜脈血管壁基質增生的報道多見于腦室周白質腦靜脈，本研究結果表明，高鹽飲食SHR大鼠深部灰質亦存在明顯的COLⅠ及LN增生，提示長期慢性高血壓下不僅白質小靜脈受累，腦灰質小靜脈也存在血管壁基質增生。

值得注意的是，有報道指出，嚙齒類動物皮質小靜脈數(shù)目遠多于小動脈[16]，而人腦皮質小靜脈數(shù)目遠少于小動脈，加之在病理研究中，對于小動脈及小靜脈的區(qū)分鑒別方法尚不成熟[4]，可能在一定程度上減少了對人腦灰質小靜脈血管壁基質增生的報道。同時有研究者推測，由于在人腦皮質中單支小靜脈負責引流多支小動脈，因此皮質小靜脈受累時可能同時波及多支小動脈供應腦區(qū)[16]，因此皮質小靜脈形態(tài)及功能可能是腦血管病中一道重要關口。既往研究顯示，長期高血壓導致小動脈硬化過程中，小動脈α-SMA表達下降[4]。本研究中高鹽飲食SHR大鼠為10月齡，其小動脈α-SMA表達下降可能更明顯，此外， 我們在本實驗中所取層面白質區(qū)占解剖區(qū)域較小，因此未能捕捉到腦白質區(qū)α-SMA明顯表達以鑒別小動脈及小靜脈，后期未選取白質區(qū)觀察小靜脈管壁基質改變。目前已有研究提示，白質靜脈病變可能在皮質下微梗死中起重要作用[17]，而人腦灰質小靜脈病變情況及其是否與皮質微梗死有關仍需進一步研究。

小靜脈血管壁基質增生的機制可能與上游小動脈病變后低灌注引起的氧化應激相關[18]，也可能與上游小動脈硬化導致下游小靜脈血流動力學改變進而引起的生物力學反應有關[19]，而小靜脈血管壁基質增生導致的引流不暢進一步加重動脈病變，形成惡性循環(huán)。因此未來研究需關注于腦小靜脈血管壁基質增生的機制及其是否參與CSVD發(fā)病機制中。