龐贊，張瑤，劉立芹，呂振明

(海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘利用國(guó)家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江海洋大學(xué)，浙江 舟山316022)

雌激素(estradiol, E2)是影響動(dòng)物性腺分化、性成熟及生殖活動(dòng)重要的性類固醇激素，在脊椎動(dòng)物中，雌激素通過與雌激素受體(estrogen receptor，ER)相互作用來發(fā)揮其生物學(xué)功能[1]。在軟體動(dòng)物中，雌激素同樣在生殖方面發(fā)揮著重要功能。如在真蛸(Octopusvulgaris)和砂海螂(Myaarenaria)的研究中發(fā)現(xiàn)，生物體內(nèi)的雌激素濃度隨生殖周期的轉(zhuǎn)換而呈現(xiàn)出顯著波動(dòng)，暗示了其在生殖活動(dòng)中的重要功能[2-3]。在蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)的研究中發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)雌激素注射可有效促進(jìn)配子細(xì)胞的生成[4]；在太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的研究中發(fā)現(xiàn)，雌激素注射則可有效促進(jìn)卵黃蛋白原的合成和配子的成熟[5]。然而，在軟體動(dòng)物中，雌激素則可能并非是通過與雌激素受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能。雖然在軟體動(dòng)物中也成功克隆得到了類似于脊椎動(dòng)物的ER基因，但由于其蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)與脊椎動(dòng)物的ER相比發(fā)生了顯著的變異，故而不能與雌激素或其他性類固醇激素結(jié)合而激活[6]。因此，在軟體動(dòng)物中，有關(guān)雌激素通過何種信號(hào)途徑發(fā)揮其生物學(xué)功能的問題，目前還并不清楚。但近年來，在軟體動(dòng)物中一種與ER同源的雌激素相關(guān)受體(estrogen-related receptor,ERR)的發(fā)現(xiàn)，可能為探究雌激素的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制提供了新的途徑。

ERR是一類與ER有較高同源性的孤兒核受體，最早是由Giguere等[7]于1988年提出，是針對(duì)ER的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)的保守序列，采用低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交方法篩選得到的。目前在脊椎動(dòng)物中主要發(fā)現(xiàn)了ERRα、ERRβ和ERRγ3個(gè)亞型[8]，相關(guān)研究表明，ERR除參與骨骼發(fā)生、胚胎發(fā)育和能量代謝外，在脊椎動(dòng)物生殖發(fā)育中同樣起著重要的調(diào)控作用[9]。ERR基因在大鼠生殖系統(tǒng)中進(jìn)行大量表達(dá)，其表達(dá)周期從生殖細(xì)胞開始一直維持到性別的分化，ERR的缺失能使生殖細(xì)胞的數(shù)量顯著減少[10]；相反，ERR的過表達(dá)可促進(jìn)生殖系統(tǒng)性激素的大量分泌[11]，暗示了ERR的生殖調(diào)控功能。然而ERR生物學(xué)功能的發(fā)揮并不依賴于ERR與雌激素受體的結(jié)合，而是通過單體或同源二聚體的形式直接結(jié)合于下游基因的雌激素響應(yīng)元件(estrogen responsive element，ERE)或雌激素相關(guān)受體響應(yīng)元件(EERE)上，從而調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，但ERR的功能卻可被雌激素濃度依賴性地調(diào)節(jié),雌激素的添加可顯著增強(qiáng)ERR的活性及其生理作用[12]，暗示了ERR在雌激素信號(hào)途徑中發(fā)揮著重要作用。然而目前，ERR在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮的生物學(xué)功能及其信號(hào)途徑仍未闡明，有關(guān)其在軟體動(dòng)物中的生殖調(diào)控作用及其機(jī)制則知之甚少。

本研究首次在2種頭足類動(dòng)物：曼氏無針烏賊(Sepiellajaponica)和白斑烏賊(Sepialatimanus)中克隆得到了ERR全長(zhǎng)序列，比較分析了其在2種烏賊不同組織的表達(dá)特性，探究了其在不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜，并與其他軟體動(dòng)物中的ERR基因研究相比較，為探究ERR在軟體動(dòng)物頭足類中的生殖調(diào)控功能及其作用機(jī)制積累資料，同時(shí)也為軟體動(dòng)物頭足類的人工繁育和健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于ERR基因克隆、組織特異性表達(dá)研究的曼氏無針烏賊和白斑烏賊為2016年3月取自廣東省湛江硇洲島自然海域的繁殖親體，曼氏無針烏賊體重約為100～150 g，白斑烏賊約為800～1 200 g，經(jīng)活體解剖，取腦、肝臟、鰓、肌肉和卵巢等組織，液氮保存?zhèn)溆?。用于不同性成熟階段ERR表達(dá)檢測(cè)的樣品分別于2016年1月、3月和5月取自硇洲島海域。南海海域的曼氏無針烏賊和白斑烏賊于每年秋季性腺開始發(fā)育，到次年的2～3月進(jìn)入繁殖季節(jié)[13-14]，因此，實(shí)驗(yàn)分別選取1月份(性腺已經(jīng)發(fā)育但尚未完全成熟)、3月份(繁殖期，性腺已完全成熟)和5月份(產(chǎn)卵已經(jīng)結(jié)束，為性腺耗散期)的烏賊，取卵巢組織，液氮保存?zhèn)溆茫糜诳疾觳煌l(fā)育時(shí)期ERR的表達(dá)特性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ERR基因的克隆

取烏賊肝臟組織，采用Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，USA)，參照說明書的方法進(jìn)行RNA的提取。RNA經(jīng)Nanodrop ND-2000(Thermo electron corporation, USA)分光光度計(jì)定量和瓊脂糖檢測(cè)后，用DNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)去處多余的DNA，純化的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen, USA)反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈后，以此cDNA為模板，以課題組構(gòu)建的曼氏無針烏賊轉(zhuǎn)錄組中注釋的ERR序列設(shè)計(jì)引物(表1)，擴(kuò)增2種烏賊的ERR核心片斷。PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，內(nèi)含100 ng模板cDNA、1×buffer、2.0 mmol/L MgCl2、0.2 μmol/L各種引物、0.2 mmol/L dNTPs和4.0 U的TaqDNA聚合酶 (Promega, USA)。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物鏈接到pGEM-T載體(Promega, USA)后，送至上海生工公司雙向測(cè)序。采用3′RACE 和 5′RACE擴(kuò)增的方法獲得ERR的全長(zhǎng)序列，其基本過程如下：根據(jù)已獲得ERR核心片斷設(shè)計(jì)3′RACE上游引物和5′RACE下游引物(表1)，以SMARTTMRACE試劑盒(Clontech, Palo Alto, CA, USA)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，用3′RACE和5′RACE引物與SMARTTMRACE試劑盒自帶的通用引物配對(duì)，并參照試劑盒說明書進(jìn)行ERR基因3′和5′端序列的擴(kuò)增。所有的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鏈接到pGEM-T載體(Promega, USA)后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 序列特征與系統(tǒng)進(jìn)化

將獲得的2種烏賊ERR全長(zhǎng)序列與GeneBank中的ERR基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析其同源性；采用cNLS Mapper軟件(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)分析核定位序列。采用SMART軟件(http://smart.emblheidelberg.de/)預(yù)測(cè)ER的保守結(jié)構(gòu)域。采用Clustal W程序進(jìn)行ERR基因的同源比對(duì)，采用Mega 3.1軟件采用neighbor-joining法進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，并采用bootstrap重復(fù)抽樣1 000次檢驗(yàn)聚類樹各分支置信度。

1.2.3ERR基因的組織特異性表達(dá)研究

采用qRT-PCR法定量分析ERR在2種烏賊不同組織中得表達(dá)情況。從性成熟的烏賊腦、肝臟、鰓、肌肉和卵巢等組織中提取總RNA，采用DNase I去處多余的DNA，純化的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA模板。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用SYBR PrimeScriptTMRT(Perfect Real Time)(TaKaRa, Kusatsu, Japan)試劑盒進(jìn)行ERR基因的實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，所用引物見表1。PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系，內(nèi)含10 μL的SYBR熒光染料預(yù)混extaq酶(TaKaRa)，100 ng 第一鏈cDNA，0.2 μmol/L雙向引物。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)2-ΔΔCt法計(jì)算，每種組織基因表達(dá)量以5個(gè)樣本的均值來確定，隨機(jī)選擇一個(gè)組織設(shè)定其基因表達(dá)量為100%，其他組織的表達(dá)量則以相對(duì)于該組織的相對(duì)表達(dá)量為計(jì)，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件比較分析ERR在每種組織中的表達(dá)差異，檢驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行表1EER基因克隆和表達(dá)試驗(yàn)中所使用引物的方差齊性分析，方差齊性則運(yùn)用 LSD 法進(jìn)行單因素方差多重比較，方差非齊性則采用Tamhane’ T2法進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Duncan氏多重比較各實(shí)驗(yàn)組間差異的顯著性，P<0.05定義為有顯著性差異。

表1 EER基因克隆和表達(dá)試驗(yàn)中所使用的引物Tab.1 Primers of theEERgene in cloning and expression analysis

1.2.4ERR基因發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性分析

為檢測(cè)不同性腺發(fā)育時(shí)期的烏賊ERR基因在性腺的表達(dá)情況，分別選取1月、3月和5月的卵巢組織，參照如上方法進(jìn)行RNA提取、cDNA鏈反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR擴(kuò)增，分析不同性成熟階段烏賊卵巢ERR基因的表達(dá)情況，同樣采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件比較分析ERR在不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種烏賊ERR基因cDNA的特征

采用5′和3′RACE技術(shù)獲得了曼氏無針烏賊和白斑烏賊的ERR基因的全序列，分別長(zhǎng)1 513 bp(Gene Bank號(hào)：MG518633)和1 547 bp(Gene Bank號(hào)：MH508243)，包含一個(gè)長(zhǎng)片段的開放閱讀框ORF(SjEERaa1-339;SlEERaa 1-351)，一個(gè)小片段的5′-UTR(SjEER12 bp;SlEER127 bp)，一個(gè)小片段的3′-UTR(SjEER109 bp;SlEER109 bp)(圖1)。結(jié)構(gòu)域分析表明，2種烏賊的開放閱讀框都可檢測(cè)到典型的ERR基因家族結(jié)構(gòu)域，分別包含N端的A/B結(jié)構(gòu)域，DNA結(jié)合C結(jié)構(gòu)域(DBD)，連接D結(jié)構(gòu)域，配體結(jié)合E結(jié)構(gòu)域(LBD)(圖2)。核定位信號(hào)序列預(yù)測(cè)表明，2種烏賊的C～E結(jié)構(gòu)域中均存在2個(gè)核定位信號(hào)序列(NLS)(圖2)，呈現(xiàn)出其核受體的基本特征。氨基酸序列比較表明，曼氏無針烏賊、白斑烏賊的ERR與同為頭足類的雙斑蛸(Octopusbimaculoides)的ERR同源性最高，分別達(dá)95%和85%，其次是蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)，同源性分別達(dá)69%和67%。2種烏賊ERR的相似性較高，可達(dá)99%，而2種烏賊與脊椎動(dòng)物的同源性相對(duì)較差。不同物種ERR不同，結(jié)構(gòu)域的保守性也相去甚遠(yuǎn)，其中A/B、D結(jié)構(gòu)域，不同物種差異較大，C(DBD)、E(LBD)結(jié)構(gòu)域則相對(duì)保守，但相對(duì)而言，C(DBD)結(jié)構(gòu)域的保守型更高，2種烏賊與蝦夷扇貝C(DBD)結(jié)構(gòu)域的相似性分別高達(dá)95%和92%。這可能是因?yàn)樵诖萍に厥荏wER中LBD是配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，依靠其獨(dú)特的構(gòu)型與雌激素E2結(jié)合而啟動(dòng)雌激素信號(hào)通路，強(qiáng)大的選擇壓力使該結(jié)構(gòu)域異常保守[6]。

然而，由于ERR是孤兒受體，其行使功能時(shí)并不依靠LBD結(jié)構(gòu)域與E2的結(jié)合，因此ERR中的LBD結(jié)構(gòu)域因配體結(jié)合功能的喪失已出現(xiàn)了較多的變異(圖2)。而ERR中的DBD結(jié)構(gòu)域則是一個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域，在ERR信號(hào)通路中，其掌控ERR與DNA的結(jié)合，從而啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄，即ERR可在無E2結(jié)合的狀態(tài)下以單體或者同源二聚體的形式與目標(biāo)調(diào)控基因上的ERE或ERRE(ERRresponsive element)位點(diǎn)結(jié)合，從而起到調(diào)控轉(zhuǎn)錄的目的[15]，該功能性的DBD結(jié)構(gòu)域可能因受到了強(qiáng)大的選擇壓力而顯得比LBD更加保守(圖2)。

圖1 2種烏賊核苷酸ERR基因cDNA全序列帶下劃線的ATG為啟動(dòng)子, TGA(*)為終止子。Fig.1 The full length cDNA sequences of the ERR from S. jaopinca and S. latimanusThe underlined ATG shows the position of the start codon and TGA(*) shows position of the stop codon.

圖2 2種烏賊與其他動(dòng)物ERR氨基酸序列比對(duì)圖Fig.2 Alignment of deduced ERR amino acid sequences from S. japonica and S. latimanus with other animal speciesInformation of gene accession：曼氏無針烏賊S.japonica(MG518633); 白斑烏賊S.latimanus(MH508243); 雙斑蛸O.bimaculoides(XP_014789866.1); 蝦夷扇貝M.yessoensis(XP_021379968.1);紅點(diǎn)鮭S.alpinus(XP_023830199.1); 鴿C.livia(PKK24791.1);褐家鼠R.norvegicus(AAQ90023.1).

圖3 基于NJ的ERR氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)聚類圖Fig.3 Phylogenetic tree based on ERR amino acid sequences by neighbor-joining methodInformation of gene accession:雞Gallus gallus ERRγ(NM_001007081.1);鴿Columba livia ERRγ(XM_005510041.3);人Homo sapiens ERRγ(AB362218.1);褐家鼠Rattus norvegicus ERRγ(AY341057.1);斑馬魚Danio rerio ERRγ(AY556397.1);紅點(diǎn)鮭Salvelinus alpinus ERRγ(XM_023974431.1); 豬Sus scrofa ERRβ(KP717448.1);人Homo sapiens ERRβ(BC131517.1);大黃魚Larimichthys crocea ERRβ(XM_027274496.1);底鱂Fundulusheteroclitus ERRβ(DQ241377.1);青鳉Oryziaslatipes ERRα(XM_011483687.3);斑馬魚Danio rerio ERRα(AY556395.1);人Homo sapiens ERRα(NM_004451.5);豬Sus scrofa ERRα(NM_001170521.1)；曼氏無針烏賊Sepiella japonica ERR(MG518633)；白斑烏賊Sepia latimanus ERR(MH508243)；雙斑蛸Octopus bimaculoides ERRγ(NW_014776465.1); 蘋果螺Marisa cornuarietis ERR(DQ923065.1);紫貽貝Mytilus edulis ERR(AB257133.2);太平洋牡蠣Crassostrea gigas ERRγ(AB259818.1); 美洲牡蠣Crassostrea virginica ERRγ(XM_022473131.1).

NJ系統(tǒng)樹構(gòu)建表明，在現(xiàn)有動(dòng)物中主要存在3種ERR亞型，分別為ERRα、ERRβ和ERRγ。脊椎動(dòng)物中3種亞型的ERR都存在，而在無脊椎動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)一種類型的ERRγ。本研究盡管采用多種兼并引物，但僅擴(kuò)增得到了1種ERR，該結(jié)果與本課題組在烏賊轉(zhuǎn)錄組文庫中注釋到僅1種ERR的結(jié)果相一致[16]，在其他軟體動(dòng)物中，至今也僅發(fā)現(xiàn)了1種ERR基因，表明在頭足類等軟體動(dòng)物中確實(shí)可能僅存在一種亞型的ERR。聚類分析表明，2種烏賊的ERR與軟體動(dòng)物ERRγ聚為一支，而與脊椎動(dòng)物的其他亞型ERR分歧較大，因此認(rèn)為本研究克隆得到的ERR可能為ERRγ亞型(圖3)。

2.2 2 種烏賊ERR基因的組織特異性表達(dá)

采用qRT-PCR法分析了繁殖期2種烏賊腦、卵巢、鰓、肌肉和肝臟中ERR的特異性表達(dá)，結(jié)果表明，2種烏賊ERR基因在不同組織中表達(dá)譜相仿，所有組織中均檢測(cè)到了ERR基因的表達(dá)，然而其在生殖相關(guān)組織中，如卵巢、腦和肝臟中的表達(dá)量明顯高于其他組織，特別是卵巢中其表達(dá)量顯著高于其他組織(P﹤0.05)，為鰓、肌肉等非繁殖相關(guān)器官的30～40倍(圖4)。在大鼠模型中，ERR也在大鼠生殖系統(tǒng)中大量表達(dá)，其表達(dá)從生殖細(xì)胞開始一直維持到性別的分化[11]。在昆蟲中，ERR在擬黑多刺蟻(Polyrhachisvicina)[17]、黃臉油葫蘆(Teleogryllusemma)等性腺中表達(dá)量較高[18]。在魚類中，ERR在青鳉(O.latipes)和底鳉(F.heteroclitus)的腦和性腺中表達(dá)量最高[19-20]，目前對(duì)ERR在軟體動(dòng)物中表達(dá)的相關(guān)研究較少，ERR在蘋果螺(Marisacornuarietis)[21和貽貝(Mytilusedulis)[22]的生殖腺中大量表達(dá)，這些結(jié)果均說明ERR可能在軟體動(dòng)物的生殖發(fā)育和性成熟中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

圖4 2種烏賊ERR基因的組織特異性表達(dá)分析柱狀圖上不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。下同。Fig.4 qRT-PCR analysis of SjEER and SlEERmRNA expression in different tissues of the female cuttlefishBars with different letters are significantly different (P<0.05).The same below.

2.3 不同性腺發(fā)育時(shí)期2種烏賊ERR基因的變化

由于ERR在2種烏賊卵巢中的表達(dá)量均最高，因此研究采用qRT-PCR法分析了不同繁殖階段的2種烏賊卵巢中ERR的表達(dá)特征。結(jié)果表明，2種烏賊ERR的表達(dá)都隨不同繁殖階段而呈現(xiàn)出明顯的波動(dòng)：在1-3月隨著性腺發(fā)育和繁殖季節(jié)的到來而顯著升高(P<0.05)；5月隨著性腺耗散和繁殖季節(jié)的結(jié)束而顯著降低(P<0.05)(圖5)。ERR在性腺中的表達(dá)量隨性腺發(fā)育時(shí)期的變化周期性的波動(dòng)還見于黃臉油葫蘆[18]和擬黑多刺蟻[23]中，在底鳉中ERR的表達(dá)受雌激素的顯著調(diào)控[20]，這些結(jié)果進(jìn)一步表明ERR可能在烏賊性腺發(fā)育及生殖過程中起重要的調(diào)控作用。

圖5 2種烏賊ERR基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性分析Fig.5 qRT-PCR analysis ofSjEERandSlEERmRNA expression in different season of the female cuttlefish

3 結(jié)論

本研究克隆得到的2種烏賊的雌激素相關(guān)受體ERR為典型的核受體基因，具NLS信號(hào)序列，具備典型的A/B、C、D和E 4個(gè)典型的雌激素受體結(jié)構(gòu)域。該ERR受體為ERRγ亞型受體，與軟體動(dòng)物的ERRγ高度同源。2種烏賊ERR基因在腦、肝及卵巢等生殖相關(guān)器官中表達(dá)量最高，在卵巢中的表達(dá)量隨性成熟時(shí)間的推進(jìn)而呈現(xiàn)顯著波動(dòng)，表明其在烏賊生殖發(fā)育和性成熟過程中起著重要的調(diào)控作用。