黃會，劉慧慧，李佳蔚，杜靜，韓典峰，張華威，張秀珍*

(1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實驗室 山東 煙臺 264006；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201606)

微囊藻毒素(microcystins，MCs)是由銅綠微囊藻(Microcystemaeruginosa)、魚腥藻(Anabaenasp.)和顫藻(Oscillatoriasp.)等淡水藍(lán)藻產(chǎn)生的一類單環(huán)七肽類肝毒素，是富營養(yǎng)化淡水水體中最常見的藻類毒素之一，具有毒性大、分布廣和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)[1]。MCs結(jié)構(gòu)通式見圖1，其環(huán)肽結(jié)構(gòu)中含有X和Y兩個可變氨基酸基團(tuán)，X和Y的不同氨基酸組合可以形成相應(yīng)的MCs異構(gòu)體，Adda鏈?zhǔn)荕Cs生物活性表達(dá)必需的結(jié)構(gòu)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的MCs達(dá)90多種，其中MC-LR、MC-RR和MC-YR等(L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)是目前研究較多的種類[2]。20世紀(jì)90年代以后，全國淡水水體富營養(yǎng)狀態(tài)日益嚴(yán)重，涉及范圍不斷擴(kuò)大，自然界大型湖泊、河流水華暴發(fā)時，藍(lán)藻中的MCs迅速釋放和溶解，使水環(huán)境中毒素達(dá)到較高濃度，造成潛在的生態(tài)風(fēng)險[3]。據(jù)報道，淡水水體中，MCs總含量通常在0.1～1.0 μg/L，當(dāng)水華藻類大量腐敗消解時，MCs含量最大可達(dá)80～90 μg/L[4]，遠(yuǎn)超國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5749—2006 《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的MC-LR最大殘留限量(1.0 μg/L)。

圖1 微囊藻毒素結(jié)構(gòu)通式Fig.1 Chemical structures of microcystins

目前國內(nèi)外對MCs的污染調(diào)查主要集中在淡水水域中，對海洋環(huán)境中MCs污染監(jiān)測較少。國內(nèi)在長江流域[5]與多個內(nèi)陸湖(如太湖[6]、巢湖[7]、鄱陽湖[8]、滇池[9]和洱海[10]等)，及國外的內(nèi)陸湖(如德國Wannsee湖[11]、美國Ronkonkma湖[12]、日本Mikata湖[13]和摩洛哥Dayet-Aaoua湖[14])等自然水體中均檢測到多種MCs；在北京官廳水庫[15]、太原市汾河一庫、二庫[16]、秦皇島洋河水庫[17]和韓國Daechung水庫[18]等飲用水源水體中也均檢測到不同濃度的MCs，且部分已超過世界衛(wèi)生組織(WHO)《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》中限定的Ⅱ類水體MC-LR安全值(1.0 μg/L)。淡水藍(lán)藻水華及其產(chǎn)生的MCs經(jīng)地表徑流匯入海域水體，在深圳灣臨近海域[19]、日本Isahaya灣入?？赱20]、美國California河口和近岸[21]等海域環(huán)境中均已檢測到MCs。

MCs不僅會對水環(huán)境生態(tài)健康造成潛在的生態(tài)風(fēng)險，還可以被水生動物富集，對其產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)，造成潛在的食品安全問題，威脅人類健康。自1878年首次報道了動物由于飲用含藍(lán)藻的水而導(dǎo)致死亡的事件以來，國內(nèi)外因藻毒素引起的水生動物、鳥類、畜類甚至人類中毒和死亡的事件時有發(fā)生，MCs污染己成為一個不容忽視的全球環(huán)境問題。已有研究顯示，MCs可在貝類、魚和蝦等多種水產(chǎn)品中富集[22]，MCs對水生生物的肝臟、腎臟、腸及心臟會產(chǎn)生一定毒害作用，并與人類原發(fā)性肝癌有一定關(guān)聯(lián)[23]。

文獻(xiàn)調(diào)研顯示，國內(nèi)外針對MCs的研究主要集中在產(chǎn)生原因[24-25]、毒性效應(yīng)[26-27]、檢測方法[28-29]及水處理過程中MCs的去除[30-31]等方面。為進(jìn)一步推動水產(chǎn)品中MCs檢測技術(shù)研究，更好地解決水體及水產(chǎn)品中MCs監(jiān)測及風(fēng)險評價，本文利用文獻(xiàn)綜述法，從MCs對水生動物的毒性、水產(chǎn)品中MCs檢測分析方法及污染狀況等角度梳理概述前期研究情況，提出MCs檢測方法的展望，以期為建立更加便捷、靈敏和環(huán)保的檢測分析方法和日后開展水產(chǎn)品中MCs監(jiān)測及制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 微囊藻毒素毒性

近年來國內(nèi)外在MCs的毒性研究方面做出了大量的工作，MCs對水生生物有肝毒性、免疫毒性，還可對腦、腎和鰓等器官產(chǎn)生不利影響。

1.1 肝毒性

MCs主要作用于水生動物肝臟或肝胰腺，通過與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸激酶2A結(jié)合，可專一性地抑制二者酶活性，引起多種蛋白質(zhì)過磷酸化、破壞肝細(xì)胞的骨架、改變肝細(xì)胞膜通透性，使肝細(xì)胞發(fā)生形變進(jìn)而喪失功能，最終造成肝出血或肝功能受損[32]。Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)經(jīng)不同濃度的MC-LR作用30 d后，其肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化物酶(POD)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)等免疫酶活性均受到不同程度激活和抑制，從而影響蝦肝胰腺正常功能。Paulino等[27]經(jīng)腹腔注射100 ng/gMC-LR對熱帶魚(Hopliasmalabaricus)進(jìn)行染毒試驗，發(fā)現(xiàn)MCs通過抑制魚體內(nèi)酸性磷酸酶(ACP)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等酶活性造成肝功能紊亂，致使肝細(xì)胞形態(tài)異常，對魚類肝臟造成不可逆損傷。Ernst等[33]研究了歐洲白鮭(Coregonuslavaretus)暴露于浮絲藻(Planktothrixrubescens)懸浮液時其肝臟的病理變化，結(jié)果顯示，胞質(zhì)呈顆粒狀，儲存的糖原減少，肝結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞分離，染色質(zhì)著邊，壞疽甚至細(xì)胞凋亡。隗黎麗等[34]采用50 ng/g的MC-LR對草魚進(jìn)行腹腔注射，在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，MC-LR可引起其肝臟細(xì)胞間的連接間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤。

1.2 免疫毒性

MCs能夠影響多種水生動物免疫酶活性、淋巴細(xì)胞活力等正常功能，使其免疫系統(tǒng)受損，產(chǎn)生免疫毒效應(yīng)[35]。陳妍妍等[36]研究發(fā)現(xiàn)對凡納濱對蝦注射MC-LR可引起其應(yīng)激反應(yīng)，并抑制其肝胰臟組織的超氧化歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化物酶等多種免疫酶活力。張雙玲等[37]將銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruguinosa)暴露于不同濃度的有毒微囊藻藻液中，發(fā)現(xiàn)其免疫酶系統(tǒng)受到破壞，酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性均有不同程度的降低。對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[38]和鯉(Cyprinuscarpio)[39]的淋巴細(xì)胞進(jìn)行一段時間MC-LR暴露染毒，虹鱒的血液和脾臟中的吞噬細(xì)胞活力下降，鯉淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡、細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生斷裂；將鯉的免疫細(xì)胞暴露在濃度為0.01和0.10 μg/mL的藻毒素中一定時間后，細(xì)胞內(nèi)免疫因子IL-1β的基因表達(dá)量增加，炎癥因子TNF-α的基因表達(dá)量則下降[40]。在對鳙(Aristichthysnobilis)的研究中發(fā)現(xiàn)，MCs不僅能夠影響免疫因子IL-8對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，同時還具有遺傳毒性，可改變免疫相關(guān)基因表達(dá)[41]。綜上可得，MCs可通過改變免疫酶活性、降低淋巴細(xì)胞活力及免疫因子基因表達(dá)等途徑影響水生生物免疫功能。

1.3 其他毒性

李效宇等[42]研究發(fā)現(xiàn)MCs可對澳洲水泡螺(Bulinusaustralinanus)的生長和繁殖等生理活動產(chǎn)生不良影響，甚至引起因饑餓或染病而導(dǎo)致的死亡。安振華等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在MC-LR脅迫下，克氏原螯蝦(Procambarusclaorkii)生長率顯著降低，機(jī)體代謝機(jī)制受損。

MCs也會對水生生物的腦、腎臟和鰓絲等組織器官產(chǎn)生不利影響。Phillips等[44]研究發(fā)現(xiàn)，MCs可引起虹鱒腦脊膜嚴(yán)重水腫，偶爾可見其小腦和大腦視區(qū)的神經(jīng)元壞死；另外，MCs可導(dǎo)致唐魚(Tanichthysalbonubes)[45]和歐洲鯉(Leucaspiusdelineatus)[46]的游泳行為發(fā)生變化，說明MCs可能會對魚類神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。Fischer等[47]給鯉喂飼含400 ng/gMC-LR的銅綠微囊藻，3 h后，其腎近端小管出現(xiàn)病理學(xué)損傷；12 h后，這些損傷出現(xiàn)在所有的腎近端小管，隨后腎臟出現(xiàn)空泡樣變。鰓是魚類呼吸器官和濾食器官，也是吸收有毒化合物的主要場所，鰓的損傷會嚴(yán)重影響魚類生理機(jī)能。王朝輝等[48]發(fā)現(xiàn)赤潮時期水體中的MCs可導(dǎo)致鰓上皮細(xì)胞固縮壞死并與其下的血管區(qū)分離。

2 微囊藻毒素檢測方法

2.1 樣品前處理方法

2.1.1 游離態(tài)MCs檢測前處理方法

水產(chǎn)品樣品主要以水產(chǎn)動物的肌肉和卵等食用組織樣本為主，為了充分提取組織中的MCs，需先將樣本打成勻漿或凍干后研磨粉碎。對水產(chǎn)品組織中MCs的含量進(jìn)行分析檢測時，需使用適當(dāng)?shù)娜軇┘拜o助手段，將目標(biāo)化合物從樣品中轉(zhuǎn)移至易于凈化、分析的提取液中。常見的水產(chǎn)品中MCs提取方法有漩渦、振蕩、熱水浴、微波輔助提取(Microwave-assisted Extraction, MAE)和加速溶劑萃取(Accelerated Solvent Extraction, ASE)等。

漩渦、振蕩和熱水浴方法操作方便，可節(jié)約有機(jī)溶劑，避免有機(jī)溶劑殘留對后續(xù)檢測的干擾。范賽等[49]在50～80 ℃條件下提取魚肉樣品中的MCs，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，80 ℃條件下熱水浴法回收率較高。MAE是常見的樣品前處理方法之一，是利用微波加熱來加速溶劑對固體樣品中目標(biāo)萃取物的萃取過程。ASE是一種能從固體和半固體基質(zhì)中提取分析物的樣品萃取技術(shù)，通過控制萃取溶劑的溫度和壓力來提高被分析物的溶解性，加快解吸動力學(xué)過程，降低溶劑黏度，加速溶劑向基體中的擴(kuò)散速度，從而提高萃取過程的速度和效率。MAE、ASE均具有耗時短、提取效率高和消耗溶劑少等優(yōu)點(diǎn)，且ASE法對粉末狀樣品中MCs的提取更高效。張玲玲等[50]采用ASE提取、凈化鯉、草蝦、河蚌和螄螺等水產(chǎn)品凍干粉末樣品中MC-RR及MC-LR，萃取劑為85%甲醇水溶液，吸附劑為弗羅里硅土，在85 ℃、10.34 MPa條件下，靜態(tài)循環(huán)萃取2次，回收率可達(dá)68.5%～86.3%。

水產(chǎn)動物組織基質(zhì)復(fù)雜，提取液經(jīng)過離心或過濾等簡單處理過程不能完全去除脂肪、蛋白等大分子，需要經(jīng)過進(jìn)一步合理、可靠的凈化手段獲得純度較高的凈化液，以減少基質(zhì)干擾帶來的偏差和對精密分析儀器的污染。目前，應(yīng)用較多的凈化方法主要包括液液萃取、固相萃取(SPE)、磁性固相微萃取[51]、基質(zhì)分散固相萃取(DSPE)和攪拌棒吸附萃取(SBSE)等；新型提取方法有免疫親和(IAC)及分子印跡聚合物(MIP)[52]等。

SPE是水產(chǎn)品前處理中應(yīng)用較為廣泛的凈化方法，可以從復(fù)雜的基質(zhì)中迅速提取待測物，且萃取率較高、穩(wěn)定性好，常用于水產(chǎn)品中MCs凈化萃取柱有弗羅里硅土柱、C18柱、硅膠柱和HLB柱等。徐瀟穎等[28]用80%甲醇溶液提取鱸、鰱、鳙、河蚌和河蝦等水產(chǎn)品中的MC-YR、MC-RR和MC-LR，并對多壁碳納米管分散固相萃取和HLB柱固相萃取兩種凈化方式進(jìn)行比較，在不同濃度水平下進(jìn)行加標(biāo)實驗，DSPE回收率為88.7%～95.5%，HLB回收率為90.8%～96.7%；雖然，HLB方法回收率較高且更穩(wěn)定，但由于DSPE法有效降低約90%的檢測成本并可有效減少約1/2的操作時間，更適用于水產(chǎn)品樣品的批量檢測。

SBSE是基于待測物質(zhì)在樣品及萃取涂層中平衡分配進(jìn)行分離萃取的一種新型的樣品前處理技術(shù)，該技術(shù)靈敏度較高，對于某些待測物檢測限可達(dá)到ng/L以下的質(zhì)量濃度水平。Cui等[29]通過對HLB/pdms涂層SBSE方法的吸附劑、pH、提取時間和解析時間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，測定了蝦夷扇貝、鮑和牡蠣等貝類樣品中7種游離態(tài)MCs含量，受萃取效率過低的影響，回收率范圍僅為51.7%～72.3%。但該方法具有良好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，且HLB/pdms涂層特異性好，可回收后反復(fù)利用，節(jié)約了檢測成本，有望進(jìn)一步提高SBSE方法的萃取效率，以便擴(kuò)大方法適用范圍。

Lawrence等[53]采用自制免疫親和柱(IAC柱)富集凈化魚肉中的MC-LR等4種MCs，在0.1～0.5 mg/kg的加標(biāo)水平下，回收率均大于73%，且IAC柱可重復(fù)使用。Adda側(cè)鏈?zhǔn)荕Cs的特征結(jié)構(gòu)，也是其生物活性表達(dá)的重要基因，可通過分子印跡技術(shù)合成對其相應(yīng)結(jié)構(gòu)具有特異性識別和選擇性吸附的聚合物，制備成MIP柱，對樣品中MCs進(jìn)行專一、高效凈化。Mbukwa等[54]開發(fā)了一種MIP方法，用于檢測水體中MC-LR含量，成功合成以L-精氨酸為模板的MIP柱，回收率為70.8%～91.4%，MIP表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附性能，制備MIP應(yīng)用于水產(chǎn)品中MCs的檢測，能夠獲得較高的回收率，具有較好的應(yīng)用前景。

表1列出了部分水產(chǎn)品中游離態(tài)MCs前處理方法。

表1 水產(chǎn)品中游離態(tài)微囊藻毒素常見前處理技術(shù)Tab.1 Pretreatment methods of free microcystins in aquatic products

旋渦、振蕩及超聲提取是較為基礎(chǔ)的提取方法，固相萃取適用于多種水產(chǎn)品中MCs前處理，回收率參考范圍為73.0%～101.1%。從方法的安全性、節(jié)能性和環(huán)保等角度，同時結(jié)合實驗材料、研究目的及實驗條件等條件考慮，合理選擇前處理方法或?qū)⑻崛　艋椒ㄓ袡C(jī)結(jié)合，有助于水產(chǎn)品中MCs前處理方法優(yōu)化。

2.1.2 結(jié)合態(tài)MCs檢測前處理方法

MCs不僅以游離態(tài)(溶解態(tài))毒素的形式在水產(chǎn)品、藻類中積累，還可以在生物細(xì)胞內(nèi)與磷酸蛋白激酶PP1A和PP2A特異性結(jié)合形成“結(jié)合態(tài)藻毒素”[61]?，F(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.273—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中微囊藻毒素的測定》中的檢測方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法。其中，LC-MS/MS法采用80%甲醇溶液提取，C18柱固相萃取凈化，檢出限為0.17～0.30 ng/g，此方法僅可測得水產(chǎn)品中游離態(tài)MCs含量。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，鯉肌肉煮熟后會使原本與磷酸酶偶聯(lián)的MCs釋放，使得MCs平均檢出量高于未煮熟的肌肉[62]。通過高溫或加入胰蛋白酶和胃蛋白酶等方法提取在太湖中采集的受污染魚類、貝類等樣品中的MCs，各實驗組得到的MCs含量均高于對照組，且蛋白酶可使MC-肽鍵斷裂、使細(xì)胞內(nèi)結(jié)合態(tài)的MCs得到釋放，使得蛋白酶組測得的MCs遠(yuǎn)高于其他組[63]。因此，研究結(jié)合態(tài)MCs及其總量檢測分析方法，對水產(chǎn)品的食用安全具有重要意義。

水產(chǎn)品中結(jié)合態(tài)MCs還可經(jīng)氧化、衍生化和甲酯化等方法處理，轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)后測定。MCs分子中Adda側(cè)鏈上的共軛雙鍵經(jīng)過氧化、衍生化、甲酯化等方法處理后，可生成自然界中尚未發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)，該前處理方法不僅可以得到樣品中游離態(tài)的MCs，還可得到結(jié)合態(tài)MCs，適用于樣品中MCs總量的提取及分析，稱為MMPB法[64]。常見的氧化劑有高錳酸鉀、高碘酸鉀、過氧化氫和臭氧等。常見的衍生化試劑有六氟丙醇、氯甲酸甲酯和二乙胺N,N-二異丙基碳酰二亞胺等。據(jù)文獻(xiàn)報道，MCs總量提取方法研究多集中在水體[65-66]和藍(lán)藻[67-68]等，因此，亟待進(jìn)一步開發(fā)水產(chǎn)品中MCs總量分析方法。

徐夏葉等[68]采用50%乙酸-甲醇溶液提取藍(lán)藻中MC-RR、MC-YR、MC-LR、MC-WR及MC-LW，經(jīng)固相萃取柱凈化，在pH為9.0的條件下以0.025 mol/L KMnO4和飽和NaIO4溶液作為氧化劑，室溫條件下反應(yīng)1 h，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定MMPB含量，回收率為82.0%～98.6%，MCs總量檢出限為0.80 ng/g。Nasri等[69]用甲醇萃取-蛋白質(zhì)磷酸酶法提取歐洲龜(Emysorbicularis)和地中海水龜(Mauremysleprosa)組織中游離態(tài)MC-LR、MC-YR和MC-RR，通過LC-MS法測定，之后用勒米厄氧化法將細(xì)胞內(nèi)結(jié)合態(tài)MCs轉(zhuǎn)化為MMPB，通過GC-MS法測定MCs總量。Bieczynski等[70]用甲醇提取阿根廷牙漢魚(Odontestheshatcheri)肝臟組織勻漿中的游離MC-LR，用蛋白磷酸酶抑制試驗法(PPIA)測定其含量；用GC-MS法測定了勒米厄氧化反應(yīng)中MMPB得到結(jié)合態(tài)MCs含量，測得MCs總量。Greer等[71]通過勒米厄氧化法將結(jié)合態(tài)MCs轉(zhuǎn)化為MMPB，獲得羅非魚中MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LA、MC-LY和MC-LF等6種MCs總量，以UPLC-MS/MS法測量。在氧化、衍生化和甲酯化等反應(yīng)中，溶劑的pH、反應(yīng)時長、氧化劑種類及氧化劑濃度等條件對反應(yīng)過程影響較大，從而影響目標(biāo)化合物的回收率。因此，可結(jié)合MMPB方法的特點(diǎn)以及水產(chǎn)品樣品的性質(zhì)，開發(fā)便捷、高效、靈敏和環(huán)保的水產(chǎn)品中MCs總量的檢測方法。

2.2 分析檢測方法

MCs的早期傳統(tǒng)檢測手段主要有小鼠腹腔注射[72]等生物分析法，以及酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)和蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)等生化分析方法。其中，生物分析法可直觀、快速地判斷MCs的提取物是否有毒性，但存在選擇性差、無法準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)。ELISA法具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但試劑盒價格昂貴，且只能檢測某一特定毒素，對某些毒素可能存在交叉反應(yīng)，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，使其在檢測中的應(yīng)用受到限制[73]。PPIA法檢測快速，但方法的特異性不強(qiáng)，不能對同系物進(jìn)行鑒別，只能檢測抑制蛋白磷酸酶的總毒素的量。目前，ELISA法和PPIA法多用于生物樣本中MCs的快速粗篩。Guo等[65]采用ELISA法和PPIA法對水中MCs進(jìn)行檢測，通過LC-MS/MS驗證，發(fā)現(xiàn)兩種生化方法均存在假陽性現(xiàn)象。

近年來，色譜法、質(zhì)譜聯(lián)用方法已越來越多地被用于檢測MCs。色譜法因具有分離效率高、靈敏度高和分析速度快等特點(diǎn)，是MCs的分析技術(shù)中的一種理想選擇。從文獻(xiàn)可以看出，應(yīng)用于MCs的分析方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)、UPLC-MS/MS以及氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)。

HPLC具有重現(xiàn)性好，選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，是MCs的檢測應(yīng)用、較多的方法之一，MCs的各同分異構(gòu)體在HPLC中常常呈現(xiàn)一個單一的峰，有利于進(jìn)行定量的檢測。在MCs的HPLC分析中，常用檢測技術(shù)包括紫外法和質(zhì)譜法。大多數(shù)MCs在238 nm波長處出現(xiàn)最大吸收峰，含色氨酸的MC-LW在222 nm波長處出現(xiàn)最大吸收峰，可在紫外檢測器設(shè)定上述波長，對HPLC流出物進(jìn)行檢測。色譜法定性的依據(jù)是保留時間，由于樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，且有大量干擾物質(zhì)存在，因此共流出是不可避免的問題。色譜法局限性主要表現(xiàn)在需要較高純度毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照才能對待測毒素進(jìn)行定性、定量，而多數(shù)MCs缺乏標(biāo)準(zhǔn)毒素。LC-MS技術(shù)可在僅得到待測毒素的分子量的情況下，能通過母離子定性定量，但對基質(zhì)干擾大的樣品判定時容易產(chǎn)生假陽性；LC-MS/MS可以通過以質(zhì)譜圖、分子離子峰的準(zhǔn)確質(zhì)量、碎片離子峰強(qiáng)比、同位素離子峰等為依據(jù)，對待測毒素進(jìn)行定性、定量，減少假陽性誤判。Kohoutek等[74]分別使用LC-MS法及LC-MS/MS法對經(jīng)過相同前處理的148個魚類樣品進(jìn)行MCs的測定，發(fā)現(xiàn)LC-MS/MS法在魚體內(nèi)的檢測到的MCs含量比LC-MS測定量低50%以上，由于LC-MS法檢測時易產(chǎn)生假陽性，從而高估了樣品中MCs含量；且MCs的LC-MS法檢出限為3.0～27.0 ng/g，LC-MS/MS法則可達(dá)到1.2～5.4 ng/g，通過比較發(fā)現(xiàn)LC-MS/MS法靈敏度更高。因此，選擇性更強(qiáng)、靈敏度更高的LC-MS/MS技術(shù)可提供更可靠的檢測結(jié)果。

有學(xué)者專門對鯰中MC-RR、MC-YR、MC-LR、MC-WR、MC-LA、MC-LY、MC-LW和MC-LF 8種MCs分別采用酶聯(lián)免疫法和LC-MS/MS法進(jìn)行檢測，并比較兩種檢測方法的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LC-MS/MS分析中，在負(fù)離子模式下使用電噴霧電離幾乎沒有干擾，基體效應(yīng)也很小，檢測限<10 ng/g，不存在假陽性現(xiàn)象；酶聯(lián)免疫法僅能對MCs進(jìn)行定性，不能區(qū)分MCs種類及MCs的準(zhǔn)確含量[60]。但這兩種方法均不能分離、檢測共價結(jié)合態(tài)的MCs。

通過表2列出的檢出限等參數(shù)可以看出，LC-MS/MS技術(shù)在MCs檢測中應(yīng)用較為廣泛，且靈敏度遠(yuǎn)高于HPLC，可以效地檢測出痕量的MCs，被越來越廣泛地用于魚、蝦和貝等各介質(zhì)中MCs的痕量分析。

表2 微囊藻毒素在水產(chǎn)品樣品基質(zhì)中的檢測方法Tab.2 Detection methods of microcystins in different aquatic products

注：“—”表示未檢出。

GC-MS技術(shù)主要用于MMPB法的MCs總量分析檢測，能快速、靈敏并準(zhǔn)確地定量分析痕量總MCs。由于MMPB揮發(fā)性較差，一般通過柱前衍生化，將MMPB的羧基進(jìn)行衍生化來提高其揮發(fā)性，以達(dá)到有效地改善色譜峰形、提高儀器靈敏度的目的，更有利于進(jìn)行GC-MS分析。

3 水產(chǎn)品中微囊藻毒素污染狀況

溶解態(tài)MCs主要通過皮膚及消化道器官吸收、食物鏈轉(zhuǎn)移等途徑進(jìn)入水生生物體。MCs可在淡水水生植物以及魚、蝦和貝等多種水產(chǎn)品中累積、殘留，對生物體產(chǎn)生一定的生理毒性，并且會使水產(chǎn)品食用安全存在隱患，經(jīng)食物鏈傳遞最終對人體健康產(chǎn)生不良影響[76]。2003年，Chen等[77]在巢湖中自然生長的秀麗白蝦(Exopalaemonmodestus)、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)和克氏原螯蝦等的肌肉、肝臟和生殖腺中，均檢測到一定量的MCs，平均含量范圍40.0～4 290.0 ng/g D.W.(干重，dry weight)，基于WHO規(guī)定的MCs對人體的每日耐受攝入量(TDI)0.04 ng/g·d B.W.(以MC-LR為基準(zhǔn))[32]對蝦肌肉、肝臟和生殖腺中的MCs進(jìn)行健康風(fēng)險評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品MCs含量最高值達(dá)到WHO推薦的TDI安全值的14.2倍，存在一定的健康風(fēng)險。張君倩等[9]于2008年1月及5～10月對滇池螺螄(Margaryamelanioidesnevill)樣品中MCs含量進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，螺螄肝胰腺、性腺以及肌肉中均檢測到MCs，最低平均含量為(350±430) ng/g D.W.，性腺及肌肉中MCs含量均超過WHO推薦的TDI安全值；MCs在各組織中含量最高值出現(xiàn)在7月，推測與藍(lán)藻水華爆發(fā)存在相關(guān)性。墨西哥Lago Catemaco湖的福壽螺(Pomaceapatulacatemacensis)肌肉中也檢測到大量的MCs[78]。希臘Pamvotis湖食物網(wǎng)中浮游植物、浮游動物、蝦、貽貝、蝸牛、鯉和青蛙等體內(nèi)均檢測到顯著的MCs[79]。

淡水魚是世界各國普遍食用且產(chǎn)量較高的水產(chǎn)品，MCs在淡水魚體內(nèi)的殘留及其造成的人類健康風(fēng)險已越來越受到關(guān)注。徐海濱等[80]調(diào)查發(fā)現(xiàn)鄱陽湖采集的鯉肝臟中MCs含量范圍為2.80～27.2 ng/g；蒲朝文等[5]發(fā)現(xiàn)三峽庫區(qū)采集的長江魚肌肉中MCs平均含量范圍為0.244～0.569 ng/g；賈軍梅等[81]從太湖的梅梁湖、西部沿岸區(qū)、南部沿岸區(qū)和湖心區(qū)采集鰱、鯉和鯽等樣品，發(fā)現(xiàn)其肌肉及肝臟等器官均發(fā)現(xiàn)MCs，且均超過WHO的TDI安全值。

國外也相繼報道了一些關(guān)于MCs在淡水水產(chǎn)品中污染狀況的研究，結(jié)果顯示，MCs在國外魚、蝦及貝等淡水產(chǎn)品中也廣泛存在。Magalh?es等[82]報道了2009年至2010年對巴西Jacarepaguá湖中羅非魚的MCs殘留跟蹤調(diào)查結(jié)果，結(jié)果表明，魚肌肉中MCs最高殘留量達(dá)337.3 ng/g，低密度水華時，仍然有71.7%的樣品中MCs含量超過WHO的TDI安全值，且肌肉中MCs含量與藍(lán)藻水華的爆發(fā)相關(guān)。Mitsoura等[83]在希臘Karla湖密集的藍(lán)藻水華中捕獲鯉，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定了魚肝、腎和肌肉組織中的MCs，發(fā)現(xiàn)鯉的肝和腎中出現(xiàn)了嚴(yán)重的組織病理學(xué)變化，且受損程度與MCs含量存在相關(guān)性。Singh等[84]發(fā)現(xiàn)印度瓦拉納西Lakshmikund池塘鯉和鯰的腸、腎、膽囊和鰓等多個組織中均檢出MCs，且鯰中檢出值遠(yuǎn)高于鯉，MCs累積程度存在種屬差異性，可能與其食性等有關(guān)。Amrani等[85]調(diào)查發(fā)現(xiàn)阿爾及利亞貝拉湖鯉(Cyprinuscarpio)肝胰腺中MC-LR含量范圍為343～771 ng/g D.W.，腸中為371～3 059 ng/gD.W.，肌肉中為329～680 ng/g D.W.；歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)肝胰腺中為86～333 ng/g D.W.，腸中為66～233 ng/g D.W.，肌肉中為54～67 ng/g D.W.。Semyalo等[86]對烏干達(dá)Mburo湖、Victoria湖和Murchison灣重要漁場的水樣及魚類中MCs進(jìn)行檢測，從水體及捕獲羅非魚(Oreochromisniloticus)的肝臟、卵和肌肉中檢測到MC-LR、MC-LF的存在，其中3組魚體內(nèi)游離MCs含量最高值為200 ng/g D.W.。

目前國內(nèi)外有關(guān)MCs污染狀況報道大多是關(guān)于淡水水體和淡水水產(chǎn)品，較少針對海產(chǎn)品中的MCs污染狀況進(jìn)行調(diào)查。2015年夏季，汪靖等[87]分別在福建省廈門、莆田、福州及寧德等城市采集市售花蛤、紫貽貝、螠蟶和牡蠣4種海產(chǎn)貝類共80份，所有海產(chǎn)貝類均檢出MC-YR，螠蟶、牡蠣中均檢出3種MCs；其中，MC-L最高檢出值為189 ng/g(廈門紫貽貝)；MC-RR最高檢出值為213 ng/g(寧德牡蠣)；MC-YR最高檢出值為195 ng/g(寧德花蛤)。Magalháes等[88]調(diào)查發(fā)現(xiàn)巴西Sepetiba灣中蟹類肌肉中MCs檢出范圍0.25～103.32 ng/g。經(jīng)健康風(fēng)險評價，福建約50%海產(chǎn)貝類中MCs超過WHO的TDI安全值；巴西Sepetiba灣25%的魚、蟹及蝦等肌肉中MCs超過WHO的TDI安全值。

2007年10月，Romo等[3]調(diào)查了西班牙最大的地中海Albufera湖中采集的野生魚類中MCs的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其肝臟、腸、鰓及肌肉等組織中均長檢出MCs。2007年，舊金山河口和近岸海域浮游動物、兩棲類及蛤蜊等生物組織中均檢出較高濃度的MCs，其檢出值存在季節(jié)性變化的特征，且與水華爆發(fā)有關(guān)[89]。2009 ～2010年，Rita等[90]對意大利南部Adriatic海岸養(yǎng)殖的地中海貽貝中MCs含量高達(dá)256 ng/g。2015年夏、秋季，Sedda等[91]對意大利撒丁島沿岸2個地區(qū)小圓蛤MCs污染水平進(jìn)行監(jiān)測，最高值分別為0.55和0.85 ng/g。綜上，國內(nèi)外海域中MCs在海產(chǎn)品中污染情況較為普遍，且其殘留量受季節(jié)、品種和區(qū)域等因素的影響，因此，MCs在海產(chǎn)品中的殘留情況同樣不容忽視。

另有研究表明，海洋貝類具有濾食特性，對海水中的MCs具有較強(qiáng)的富集能力，蛤蜊、海貽貝、牡蠣和海螺等對海水中MCs的富集高達(dá)107倍[92]，當(dāng)海水中MCs濃度低于檢測限時，紫貽貝中仍可檢測出MCs[93]，可見，海洋貝類對MCs富集能力較強(qiáng)。

綜上，國內(nèi)外對MCs的研究主要集中在淡水環(huán)境MCs污染狀況及淡水水產(chǎn)品中富集規(guī)律、殘留情況方面，針對海洋環(huán)境及海產(chǎn)品中MCs污染狀況調(diào)查研究相對較少；且國內(nèi)對MCs殘留限量等相關(guān)法律法規(guī)相對缺乏。為了保障食品安全及人類健康，嚴(yán)格監(jiān)測水體及水產(chǎn)品中的MCs殘留量，亟需制定水產(chǎn)品中MCs相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。

4 展望

MCs是藍(lán)藻水華中產(chǎn)生的具有環(huán)境持久性的一類生物毒素，由于其在水環(huán)境中分布廣泛，對水生植物、水生動物毒性大，已成為全球水環(huán)境健康的潛在危害物質(zhì)之一。本文發(fā)現(xiàn)，常見的MCs檢測方法研究多針對游離態(tài)MCs的提取、凈化及分析檢測，而結(jié)合態(tài)的MCs難以被完全提取，因此，難以準(zhǔn)確檢測樣品中MCs總量?，F(xiàn)有的對樣品中MCs總量的檢測方法大部分涉及衍生和高溫等處理手段，過程較為繁瑣，因此，開發(fā)高效、安全、環(huán)保和靈敏的MCs總量的檢測分析方法是實驗室檢測的重要研究方向之一。

隨著研究的深入，全球地下水、地表水甚至海洋環(huán)境等水體中均檢測到了MCs，各地淡水水產(chǎn)品廣泛檢出MCs，部分地區(qū)海產(chǎn)品中也發(fā)現(xiàn)MCs的存在。目前關(guān)于MCs在水體及水產(chǎn)品中的標(biāo)準(zhǔn)，僅見WHO制定的飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和推薦的水產(chǎn)品中TDI安全限量，而關(guān)于MCs在不同種類水產(chǎn)品(魚、蝦、蟹、貝、藻和海參)中的具體限量標(biāo)準(zhǔn)尚未見報道，中國也尚未制定MCs在海、淡水及不同種類水產(chǎn)品種的限量值。為更好地監(jiān)測管理水體及水產(chǎn)品中MCs的殘留，有必要結(jié)合WHO現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，開展水產(chǎn)品中MCs總量檢測方法標(biāo)準(zhǔn)研究。因此，研究開發(fā)水產(chǎn)品中MCs總量檢測方法，加強(qiáng)對水產(chǎn)品中MCs的殘留監(jiān)測及風(fēng)險評估，對制定水產(chǎn)品中MCs安全標(biāo)準(zhǔn)有重要意義。