顧文燕，李麗，吳敏

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000

結腸癌(colon cancer)屬于消化道最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于所有惡性癌癥的第3位[1]。結腸癌的治療主要依靠手術，然而化療整個過程易產生藥物的耐藥性，成為結腸癌患者復發(fā)或死亡的主要原因[2]。于是，解決結腸癌多藥耐藥問題已成為當前研究的熱點。研究已證實，中藥在輔助治療腫瘤中有著較好的效果，并且其引發(fā)的不良反應較少，患者可耐受藥物應用[3]。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)又稱1-異硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷，分子式為：C6H11S2NO，其結構式見圖1，是一種來源于十字花科植物的異硫氰酸酯類化合物，已發(fā)現SFN在抗乳腺癌、前列腺癌及克隆癌等多種腫瘤細胞方面均表現出較強的生物活性[4-6]。還發(fā)現SFN在一定劑量下對白血病細胞增殖具有抑制作用，還能增強化療藥物的敏感性[7]。然而SFN是否影響5-氟尿嘧啶(5-FU)對結腸癌細胞的敏感性還有待研究。5-FU為臨床上廣泛使用的基礎藥物，然而95%的結直腸癌患者出現了5-FU的抗性，極大降低了患者的治愈率。腫瘤細胞獲得耐藥性的機制是很復雜的，如藥物靶點發(fā)生變化、藥物失活、細胞內藥物的流入與流出，藥物引起的損傷及逃避凋亡等[8]。Bax信號通路對結腸癌在內的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展均表現出調控作用[9]。早期研究發(fā)現，人結腸癌細胞SW-480對5-FU能夠產生耐藥性[10]，穿心蓮內酯能夠通過上調Bax表達逆轉人結直腸癌對5-FU的耐藥性[11]。因此，本文研究了SFN能否增強5-FU對結腸癌細胞化療耐受的能力，及其對結腸癌SW-480細胞凋亡的影響。

圖1 蘿卜硫素結構式

1 材料

1.1 儀器

BBS-DDC超凈工作臺(山東博科科學儀器有限公司)；LRH-150 BOD CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(DX540，美國)；DYCZ-24DN凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；成像系統(BIO-RAD，美國)；CytoFLEX LX流式細胞儀、Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀(貝克曼，中國)。

1.2 試藥

結腸癌SW-480細胞株由武漢巴菲爾公司提供(來自美國ATCC細胞庫)；蘿卜硫素(杭州林格貝科技有限公司，含量≥99%)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(Thermo Scientific公司)；5-氟尿嘧啶(上海吉至公司，CAS66-22-8，0.25 g·(10 mL)-1；CCK8試劑盒(日本同仁公司，批號：WST-78)；RIPA裂解液(上海吉諾公司)；BCA試劑盒(北京百奧公司)；RNA提取試劑盒及superRreal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(碧云天公司)；β-actin、Bax抗體(英國Abcam公司)；HRP標記羊抗兔IgG(上海谷歌公司)；Lipo2000轉染試劑盒(上海博耀生物科技有限公司，批號：11668-027)。

2 方法

2.1 SW-480細胞培養(yǎng)

結腸癌SW-480細胞采用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，包含10%胎牛血清、1%雙抗(100 U·mL-1青霉素+100 U·mL-1鏈霉素)，培養(yǎng)箱條件設置：溫度37為℃、5%CO2濃度、恒濕。細胞生長融合至80%～90%，采用0.25%胰酶-0.125%EDTA溶液消化，顯微鏡下觀察細胞變圓后立即加入培養(yǎng)基終止消化，并以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

2.2 CCK8法檢測SW-480細胞活力

將對數生長期細胞接種于96孔板進行實驗，培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度(0、10、20、40 μmol·L-1)的SFN，聯合不同劑量的5-FU(0、5、10、20、50、100 μmol·L-1)對SW-480細胞進行干預24 h后，吸干舊培養(yǎng)液，每孔加入10 μLCCK8試劑，將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值，計算細胞活力。

細胞活力(%)=A藥物組/A對照組×100

(1)

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將對數生長期細胞接種于6孔板進行實驗，分為對照組(Control)、蘿卜硫素組(SFN組，20 μmol·L-1)、5-氟尿嘧啶組(5-FU組，5 μmol·L-1)、SFN+5-FU聯合組，待藥物干預24 h后，將收集的細胞重懸于Binding Buffer中，依次加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL，室溫避光孵育，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；圖3中右下限代表早期凋亡細胞數、右上限代表中晚期凋亡細胞數。

2.4 RT-PCR分析Bax、Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3 mRAN表達

將對數生長期細胞接種于6孔板進行實驗，藥物干預方法及實驗分組按照2.3項進行。待藥物干預細胞結束后，收集細胞加入TRIzol提取細胞總RNA，并對核酸進行濃度及純度法測定。吸去1 μg總RNA逆轉錄cDNA，程序設定為30 ℃(10 min)→42 ℃(50 min)→85 ℃(10 min)→4 ℃(5 min)。根據試劑說明書，RT-PCR體系為20 μL，cDNA 2 μL，引物4 μL，2×FastFire qPCR PreMix 10 μL，dd H2O 4 μL。擴增條件設置為：94 ℃(10 min)；94 ℃(15 s)；60 ℃(1 min)；循環(huán)40次。以β-actin作為內參，基因引物序列見表1。mRNA表達水平以2-ΔΔCt計算相對表達量，以β-actin作為內參。

表1 引物序列

2.5 Western Blot實驗

將細胞分為4組：對照組、SFN組、5-FU組及SFN+5-FU聯合組，帶藥物處理24 h后，收集藥物處理完的細胞，裂解細胞離心制備成勻漿后，采用BCA法測定總蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白進行凝膠電泳，待蛋白分離完成后進行轉膜實驗。之后采用5%脫脂牛奶對條帶進行封閉1 h，然后加入β-actin、Bax抗體(稀釋比1∶1000)4 ℃孵育過夜，洗膜后HRP標記羊抗兔IgG，室溫孵育1 h后，洗膜3次后，ECL顯色曝光，采用Image J軟件分析蛋白含量。

2.6 Bax低表達轉染實驗

低表達質粒pcDNA-Bax siRNA由武漢巴菲爾生物有限公司合成，引物序列為：F 5′-ATGTTGGGGATCCATGAGCTTCCTGAGCCGA-3′；R 5′-GGTTGGCTCGAGTCAGTATATAGTAAGGCT-3′。具體步驟如下：單鏈目的片段Bax-siRNA與線性質粒載體連接；取5 μL過夜連接產物轉化感受態(tài)細胞，涂布與含Kanar抗性的LB平板上選擇培養(yǎng)；用試劑盒小量提取質粒，用EcoRI做酶切鑒定，挑選酶切鑒定正確的質粒轉化菌液Bax-siRNA測序。NC序列為GCCTGCATCATCAAATCCA，Bax-siRNA序列為CAGTCTGAAGCACTTATAA。采用Lipo 2000轉染試劑盒進行轉染，操作按照說明書進行。將細胞接種于6孔板，待細胞融合至80%左右開始轉染；將4 μg質粒DNA加入到250 μL DMEM培養(yǎng)液中混勻，取10 μL Lipo 2000加入到另外250 μL DMEM培養(yǎng)液中混勻，室溫下靜置5 min；然后將上述兩種DMEM培養(yǎng)液混合，總體積500 μL，輕輕混勻后室溫下靜置20 min，最后將混勻溶液輕輕加入到6孔板中，轉染4～6 h后更換為新鮮培養(yǎng)液，轉染24 h后檢測Bax蛋白表達。

2.7 統計分析

3 結果

3.1 SFN增強5-FU對SW-480細胞株增殖能力的抑制效應

為了探討SFN是否增強5-FU對結腸癌SW-480細胞增殖能力的抑制效應，采用不同濃度的SFN聯合不同劑量的5-FU對SW-480細胞進行干預。見圖2。在相同劑量SFN處理前提下，聯合5-FU處理，隨著5-FU劑量的升高，SW-480細胞增殖能力明顯減弱；在相同劑量5-FU干預基礎之上，較高SFN的干預濃度可使SW-480細胞增殖活性降低。提示5-FU可抑制SW-480細胞的增殖能力，并表現出劑量依賴性；SFN還可增強5-FU對SW-480細胞增殖的抑制效應。

圖2 SFN增強5-FU對SW-480細胞增殖的抑制效應

3.2 SFN增強5-FU對SW-480細胞凋亡的誘導效應

流式細胞儀分析了SFN+5-FU聯合對SW-480細胞凋亡的影響，結果見圖3～4。表明SFN+5-FU聯合組細胞凋亡率(51.10±6.34)%顯著高于5-FU組細胞凋亡率(36.76±4.29)%，差異有統計學意義(P<0.05)。還發(fā)現5-FU組、SFN+5-FU聯合組細胞凋亡率均顯著高于對照組(9.21±3.26)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 SFN對5-FU誘導SW-480細胞凋亡的影響

注：與Control組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，#P<0.05。圖4 SW-480細胞凋亡率比較

3.3 SFN對凋亡基因mRNA表達的影響

SFN、5-FU及其聯合干預SW-480細胞后，細胞中凋亡相關的Bax、Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3基因表達結果見圖5。提示SFN+5-FU聯合組Bax基因表達量顯著高于5-FU組，差異有統計學意義(P<0.05)，說明SFN能增強5-FU對SW-480細胞中促凋亡基因Bax表達的誘導作用；然而SFN+5-FU聯合組與5-FU組中Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3基因表達水平比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。

注：與5-FU組比較，*P<0.05。圖5 SFN對SW-480細胞凋亡基因表達的影響

3.4 SFN對Bax蛋白表達的影響

SFN、5-FU及其聯合干預SW-480細胞后，Bax表達水平見圖6，提示SFN+5-FU聯合組Bax表達量顯著高于5-FU組，差異有統計學意義(P<0.05)。說明SFN能增強5-FU對SW-480細胞中促凋亡蛋白Bax表達的誘導作用。

注：與5-FU組比較，*P<0.05。圖6 SFN對SW-480細胞Bax蛋白表達的影響

3.5 低表達質粒下調SW-480細胞表達Bax

采用Bax低表達質粒轉染結腸癌SW-480細胞，應用Western Blot分析Bax蛋白表達量，結果見圖7，提示篩選的pcDNA-Bax質粒可顯著降低細胞中Bax蛋白表達。

注：與Control組比較，*P<0.05。圖7 pcDNA-Bax質粒下調SW-480細胞中Bax的表達

3.6 Bax低表達減弱SFN對5-FU的敏感性

為了探討低表達Bax是否影響SFN對5-FU的敏感性，采用pcDNA-Bax質粒轉染SW-480細胞，同時應用5 μmol·L-15-FU及20 μmol·L-1SFN對細胞進行孵育24 h后，檢測細胞活力，見圖8。提示與對照組比較，SFN+5-FU組細胞活力顯著降低(P<0.05)，而Bax低表達能明顯減弱SFN和5-FU聯合對SW-480細胞的抑制作用(P<0.05)。

注：與Control組比較，*P<0.05；與SFN+5-FU組比較，#P<0.05。圖8 低表達Bax減弱SFN協同5-FU的腫瘤抑制效應

4 討論

系統性化療已是結腸癌規(guī)范化治療必不可少的環(huán)節(jié)，術前、術后均可采用藥物進行輔助化療，提高晚期腫瘤患者獲得手術治療的機會。正是由于采用各種化療藥物對結腸癌患者進行干預，才能夠促使晚期結腸癌患者的總生存率得以提升。然而，惡性腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥是治療失敗的關鍵因素，不僅降低了患者的生存質量，還導致大量醫(yī)療資源的浪費。腫瘤細胞產生的多藥耐藥機制非常復雜，研究已證實，P-gp糖蛋白跨膜轉運能力的變化、細胞解毒活力的提升、DNA損傷修復系統紊亂及凋亡通路的異常等方面均與多藥耐藥現象有關[12]。然而無論體外研究還是臨床治療應用中，對上述耐藥因素進行干預進行耐藥逆轉，仍然存在較多問題。

SFN是一種藥理活性較強的天然活性物質，在抗腫瘤方面也具有較好的作用效果，并且還提出其具有增強白血病細胞對化療藥物的敏感性[7]。SFN通過對細胞癌變起始期的調控，誘導腫瘤細胞走向凋亡，還能夠阻滯腫瘤血管形成及降低腫瘤細胞侵襲轉移[13]。研究還發(fā)現，SFN可通過誘導促凋亡蛋白Bax表達抑制肝癌細胞增殖、誘導其凋亡及降低其侵襲轉移能力[14]。本研究發(fā)現，SFN能夠增強5-FU對結腸癌SW-480細胞增殖的抑制效應，說明SFN可誘導SW-480細胞對5-FU的敏感性；并且研究還發(fā)現，SFN+5-FU聯合處理組中SW-480細胞凋亡率比單獨5-FU組的凋亡率明顯升高，提示SFN能增強5-FU誘導的SW-480細胞凋亡。

通過流式細胞儀發(fā)現，SFN能增強5-FU誘導的SW-480細胞凋亡，于是筆者從細胞凋亡角度考察介導SFN逆轉化療耐藥可能的分子機制，對可能的凋亡相關基因(Bax、Suvivin、Bcl-2、p53及caspase-3)進行了檢測分析。結果證實，SFN+5-FU聯合組中Bax mRNA表達顯著高于其他3組。于是設想Bax可能介導了SFN逆轉結腸癌細胞耐藥的過程，但具體機制尚不清楚。Bax基因家族是目前研究較多的與凋亡相關的基因，也是最受關注的促凋亡發(fā)生的基因家族[15]。研究已發(fā)現，Bax的表達在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，Bax蛋白家族與其他家族成員構成復雜的相互作用網絡，共同調控細胞凋亡[16]。除此之外，研究已證實，Bax與腫瘤細胞的耐藥發(fā)生機制密切相關[17-18]。本文實驗結果進一步證實，SFN+5-FU聯合處理組SW-480細胞中Bax蛋白表達水平明顯高于5-FU單獨處理組。為了進一步驗證SFN通過調節(jié)Bax表達逆轉結腸癌細胞對5-FU化療的耐藥作用，采用pcDNA-Bax低表達質粒抑制結腸癌細胞中Bax表達，發(fā)現Bax低表達降低了SFN+5-FU聯合作用對SW-480細胞活力的抑制作用?？傊?，SFN可增強5-FU對結腸癌細胞增殖活力的抑制效應，并且還對Bax表達具有較強的誘導作用，提示SFN可通過增加Bax表達誘導結腸癌細胞對5-FU的敏感性。