李惠春，丁圣剛，卜笑松，王 建，王 旺，朱玉林

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)簡(jiǎn)稱金葡菌，是兒童感染的重要病原菌，它通過定植在人類和哺乳動(dòng)物身上，引起皮膚軟組織的化膿感染，甚至引起機(jī)體內(nèi)部炎癥如心內(nèi)膜炎、骨髓炎、膿毒癥等危及生命的全身性感染。隨著抗生素的研發(fā)與應(yīng)用，這些感染曾一度得到控制，但是隨著抗生素種類的增多與廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)[1]。MRSA不僅對(duì)青霉素耐藥，對(duì)和青霉素結(jié)構(gòu)相同或相似的β-內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥，甚至對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類等抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，給臨床治療帶來巨大困難[2]。而攜帶殺白細(xì)胞素(panton-vanlentine leukocidin，pvl)基因的MRSA殺傷力更強(qiáng)，pvl是由一個(gè)分子量為34 ku的lukF-PV蛋白和一個(gè)分子量為32 ku的lukS-PV蛋白組成的雙蛋白毒素成分，這兩分子協(xié)同發(fā)揮作用導(dǎo)致多形核白細(xì)胞膜穿孔，從而殺傷白細(xì)胞[3]。有研究[4]顯示其陽(yáng)性率與皮膚軟組織反復(fù)感染甚至引起壞死性肺炎密切相關(guān)。該研究通過對(duì)738株SA進(jìn)行mecA、pvl基因檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)，并對(duì)所有菌株的科室來源、標(biāo)本來源來及耐藥性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，了解安徽省各地區(qū)兒童與>14歲患者之間感染MRSA的流行病學(xué)特征及耐藥性差異，為兒童SA感染的治療提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源安徽省內(nèi)各地區(qū)共計(jì)39所醫(yī)院(包括10家省三級(jí)甲等醫(yī)院、15家市三級(jí)甲等醫(yī)院、1家縣三級(jí)甲等醫(yī)院、2家市三級(jí)乙等醫(yī)院、5家市二級(jí)甲等醫(yī)院、4家縣二級(jí)甲等醫(yī)院、1家三級(jí)民營(yíng)醫(yī)院、1家檢驗(yàn)中心)上報(bào)至安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心金黃色葡萄球菌738株(包括來源于兒童患者菌株153株與來源于>14歲患者菌株585株)，將所有菌株菌株按年齡分為兒童患者組與>14歲患者組，并對(duì)所有菌株科室來源及標(biāo)本來源進(jìn)行歸類整理。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25923(普通金黃色葡萄球菌，不含耐藥基因)及MRSA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC43300(含mecA耐藥基因)均為安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心提供。

1.2 主要試劑及儀器VITEK-2型全自動(dòng)微生物鑒定儀及配套的鑒定板和藥敏板購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；溶葡萄球菌酶、premixtaq、1 000DL Marker均購(gòu)自上海生物工程有限公司；PCR擴(kuò)增儀器購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；電泳儀儀器購(gòu)自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 菌株的鑒定及藥敏試驗(yàn)通過VITEK-2型全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行金黃色葡萄球菌鑒定及藥敏試驗(yàn)(使用配套鑒定板GP21 342及藥敏卡PC33)，質(zhì)控菌株為ATCC25923及MRSA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC43300，按照2018年CLSI標(biāo)準(zhǔn)[5]判讀藥敏結(jié)果。

1.4 mecA、pvl引物的制備PCR擴(kuò)增mecA、pvl的引物參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)，并委托上海生物工程有限公司合成，置于-20 ℃無菌冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，使用時(shí)遵使用說明合成相應(yīng)溶液。具體引物序列見表1。

表1 mecA、pvl基因擴(kuò)增引物

1.5 提取目的基因?qū)⑴R床分離提純的738株SA全部接種至直徑為9 mm的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃無菌培養(yǎng)箱中培育18～24 h，用無菌棉簽鈍頭分別從各個(gè)培養(yǎng)基中挑取4～5個(gè)菌落溶于裝有200 μl滅菌雙蒸水的尖頭EP管中，各加入10 μl溶葡萄球菌酶置于37 ℃恒溫箱中水浴30 min，然后放入電飯鍋中煮沸10 min，13 000 r/min離心10 min，最后收集上清液至EP管中，即為PCR擴(kuò)增所需模板基因。

1.6 PCR技術(shù)擴(kuò)增mecA及pvl基因產(chǎn)物

1.6.1反應(yīng)體系 分別往8連管每個(gè)管中各加入滅菌雙蒸水10.5 μl、premix taq 12.5 μl、目的基因1 μl、上下游引物各0.5 μl，配置成25 μl反應(yīng)體系，經(jīng)低速離心30 s充分混勻。

1.6.2反應(yīng)條件 95 ℃預(yù)變性5 min，然后開始95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸39 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保護(hù)，即擴(kuò)增出所要目的基因片段。

1.7 凝膠電泳PCR產(chǎn)物用含0.5 μg/ml EB的2%瓊脂糖凝膠，在1×TAE緩沖液中，100 V電泳90 min，在紫外燈下觀察結(jié)果，片段長(zhǎng)度為162 bp片段即為PCR擴(kuò)增所得的mecA片段，片段長(zhǎng)度為78 bp片段即為PCR擴(kuò)增所得的pvl片段。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對(duì)臨床統(tǒng)計(jì)資料及實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，MRSA科室來源及標(biāo)本來源用成組設(shè)計(jì)行×列表資料的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，MRSA的耐藥性差異用成組設(shè)計(jì)四格表資料的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mecA、pvl基因的PCR結(jié)果738株SA共檢出MRSA 126株，MRSA陽(yáng)性率為17.07%，檢出pvl陽(yáng)性菌株36株，陽(yáng)性率為28.57%，其中分離自兒童患者的153株SA檢出為MRSA菌株共計(jì)32株，陽(yáng)性率為20.92%，pvl陽(yáng)性MRSA菌株7株，陽(yáng)性率為21.88%，分離自年齡>14歲患者的585株SA檢出為MRSA菌株94株，陽(yáng)性率為16.07%，pvl陽(yáng)性MRSA菌株29株，陽(yáng)性率為30.85%，兒童患者與>14歲患者感染SA之間檢測(cè)mecA及pvl差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。部分mecA、pvl電泳圖見圖1。

圖1 部分MRSA mecA凝膠電泳成像圖譜

M：Marker；1～10：MRSA菌株；11～14：pvl陽(yáng)性MRSA菌株；15：pvl陽(yáng)性對(duì)照菌株菌株16;標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC43300；17：陰性對(duì)照菌株ATCC25923

2.2 MRSA菌株來源科室統(tǒng)計(jì)分析兒童患者感染MRSA主要來源于燒傷科(31.25%)、外科(15.63%)、ICU(9.38%)，與>14歲患者感染MRSA來源科室之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=40.697,P<0.001)。其中兒童感染pvl(+)MRSA主要來源于外科(57.14%)、新生兒病區(qū)(28.57%)、呼吸內(nèi)科(14.29%)，與>14歲患者感染pvl(+)MRSA來源科室之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.914,P=0.000)，具體來源科室構(gòu)成比見表2。

2.3 MRSA菌株來源標(biāo)本統(tǒng)計(jì)分析兒童感染MRSA主要來源標(biāo)本為膿液(31.25%)、痰(25.00%)、創(chuàng)面(15.63%)，與>14歲患者感染MRSA主要來源標(biāo)本之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.055,P=0.003)。兒童感染pvl(+)MRSA主要來源于膿液(71.43%)、血(28.57%)，與>14歲患者感染MRSA主要來源標(biāo)本之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.593,P=0.006)。見表3。

表2 兒童與>14歲患者感染MRSA、pvl(+)MRSA科室來源構(gòu)成比[n(%)]

表3 兒童與>14歲患者感染MRSA、 pvl(+)MRSA臨床標(biāo)本來源構(gòu)成比[n(%)]

2.4 MRSA、MSSA耐藥性統(tǒng)計(jì)分析不同種類金黃色葡萄球菌對(duì)20種常見抗生素的耐藥性差異用成組設(shè)計(jì)四格表資料的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中兒童與>14歲患者感染pvl(+)MRSA對(duì)各種常見抗生素的耐藥性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兒童與>14歲患者感染pvl(-)MRSA除對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、四環(huán)素的耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004、0.004、0.012、0.021、<0.001)，其余15種常見抗生素的耐藥性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兒童感染pvl(+)MRSA與pvl(-)MRSA對(duì)克林霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001、<0.001、P=0.009)。具體MRSA對(duì)各種抗生素的耐藥率構(gòu)成比見表4。

表4 兒童與>14歲患者感染MRSA對(duì)各種常見抗生素的耐藥率構(gòu)成比[n(%)]

3 討論

SA廣泛存在于自然界中，是兒童感染的常見病原菌，由于抗生素使用不合理及過度泛濫，導(dǎo)致機(jī)體菌群失調(diào)、重新分配，大部分敏感菌被清除，MRSA在抗生素的選擇壓力下富集。有研究[7]報(bào)道近年來兒童感染MRSA率有急劇上升趨勢(shì)，胡龍華 等[8]報(bào)道2007～2008年南昌地區(qū)兒童MRSA檢出率為10.6%，張秀平 等[9]報(bào)道2010～2015年某醫(yī)院兒童MRSA的檢出率從21.74%上升到75.59%。由于兒童免疫力較低下，且MRSA菌株多為多重耐藥菌，感染后常導(dǎo)致嚴(yán)重后果，如陳雨青 等[10]報(bào)道12例MRSA感染導(dǎo)致膿毒癥患兒經(jīng)手術(shù)、閉式引流及充分藥物治療后仍有4例不幸死亡。隨著MRSA的臨床分離率逐年升高且呈多重耐藥，兒童一旦感染，病情常較嚴(yán)重且呈急劇進(jìn)展趨勢(shì)，能用于治療的藥物越來越少，臨床治療十分困難，給患兒及親屬帶來嚴(yán)重的身心傷害。

本研究結(jié)果顯示，2017年9月份安徽省內(nèi)各地區(qū)兒童患者與>14歲患者感染金葡菌的mecA、pvl基因檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )，提示在安徽省內(nèi)MRSA是兒童患者與>14歲患者感染的同等重要病原菌。MRSA總檢出率為17.07%，兒童患者M(jìn)RSA的檢出率為20.9%，低于2014年中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)顯示的MRSA平均檢出率44.6%及兒童MRSA平均檢出率23.8%～37.6%[11]。其中pvl陽(yáng)性MRSA菌株7株，陽(yáng)性率為21.88%，低于李士朋 等[12]報(bào)道的pvl檢出率42.1% ，可能提示安徽省內(nèi)各地區(qū)抗生素使用較合理，MRSA感染防治較好，但不排除MRSA季節(jié)性低發(fā)期，由于MRSA檢出率仍較高，仍應(yīng)加強(qiáng)MRSA感染的防治意識(shí)。

本研究結(jié)果顯示，安徽省各地區(qū)兒童患者與>14歲患者感染MRSA主要來源科室之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。提示兒童患者感染MRSA主要來源于創(chuàng)傷、危重科室，如燒傷科(31.25%)、外科(15.63%)、ICU(9.38%)，主要來源科室與李麗民 等[13]報(bào)道相似。其中pvl(+)MRSA主要來源于外科(57.14%)、新生兒病區(qū)(28.57%)、呼吸內(nèi)科(14.29%)?？赡芤?yàn)闊齻苹純旱谝坏辣Ｗo(hù)屏障皮膚的受損及體液的丟失，易導(dǎo)致各種病原菌的入侵；外科患兒因?yàn)槭中g(shù)創(chuàng)傷并常伴有身體免疫力的降低，易發(fā)生各種感染，要求臨床醫(yī)護(hù)人員手術(shù)過程中嚴(yán)格遵循無菌操作規(guī)則，術(shù)后加強(qiáng)對(duì)患兒的護(hù)理，避免感染；ICU患兒病情危重，加上機(jī)械插管、中心靜脈導(dǎo)管靜置等治療設(shè)施更易發(fā)生各種感染，而一旦感染MRSA常導(dǎo)致病情加速惡化，甚至危及生命。本研究提示外科、燒傷科、ICU是兒童患者M(jìn)RSA感染的常見科室，其中外科、新生兒病區(qū)、呼吸內(nèi)科是pvl(+)MRSA感染的常見科室，因此要注意這些科室患兒感染金葡菌的mecA及pvl基因檢測(cè)，以便進(jìn)行及時(shí)有效的防治。

本研究結(jié)果顯示，安徽省各地區(qū)兒童患者與>14歲患者感染MRSA主要來源標(biāo)本之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示兒童感染MRSA主要來源標(biāo)本為膿液(31.25%)、痰(25.00%)、創(chuàng)面(15.63%)，pvl(+)MRSA主要來源于膿液(71.43%)、血(28.57%)，與相關(guān)報(bào)道[10]血、穿刺液、分泌物、膿液MRSA的檢出率分別為68.97%、66.00%、55.81%、54.47%不一致。不一致原因可能為分離菌株來源地區(qū)范圍、時(shí)間點(diǎn)不一樣。提示安徽省各地區(qū)兒科患者M(jìn)RSA主要來源于皮膚軟組織感染，其次為呼吸系統(tǒng)感染，臨床兒科醫(yī)師應(yīng)加強(qiáng)以上標(biāo)本MRSA感染的意識(shí)，加強(qiáng)與檢驗(yàn)醫(yī)師的臨床合作，注意以上標(biāo)本金葡菌mecA及pvl基因的檢測(cè)，以便更及時(shí)地發(fā)現(xiàn)MRSA感染患者并及時(shí)進(jìn)行救治，從而達(dá)到更好的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，安徽省各地區(qū)兒童患者與>14歲患者感染MRSA對(duì)多數(shù)常見抗生素的耐藥性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但感染pvl(-)MRSA對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、四環(huán)素的耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004、0.004、0.012、0.021、<0.001)，提示兒童與>14歲患者感染MRSA的耐藥性多數(shù)相似，僅對(duì)以上幾種抗生素的耐藥性有差異，應(yīng)注意根據(jù)年齡及pvl基因攜帶情況對(duì)以上藥物進(jìn)行合理應(yīng)用。兒童感染pvl(+)MRSA與pvl(-)MRSA對(duì)克林霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001、<0.001、P=0.009)，提示兒童感染pvl(+)MRSA與pvl(-)MRSA具有不同的耐藥模式。兒童感染pvl(+)MRSA主要表現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、林克酰胺類耐藥，其耐藥率分別為100%、100%、28.6%、28.6%、14.3%；pvl(-)MRSA主要對(duì)β-內(nèi)酰胺類、林克酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、喹唑酮類、喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類等具有不同的耐藥譜，其耐藥率分別為100%、88%、80%、80%、76%、20%、16%、12%，與李冬梅 等[14]報(bào)道的MRSA耐藥率相似，與魏丹丹 等[15]報(bào)道的MRSA耐藥率有所不同，可能與各個(gè)地方的地理環(huán)境、用藥習(xí)慣有關(guān)，提示不同地方的MRSA具有不同的耐藥模式。當(dāng)今社會(huì)由于抗生素的濫用，兒童感染MRSA的分離率逐年增加，且多為多重耐藥菌，MSSA也開始出現(xiàn)耐藥菌，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)，給患兒及家屬帶來巨大身心傷害，臨床兒科醫(yī)師應(yīng)盡量避免經(jīng)驗(yàn)用藥，注意根據(jù)藥敏結(jié)果制定治療方案。