袁 卉，郝吉慶

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌的85%，而大部分肺癌確診時(shí)已屬于中晚期，其5年生存率約為18%[1]。而針對(duì)驅(qū)動(dòng)基因的個(gè)體化分子靶向治療已成為晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療，特別是表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI) 已在臨床上被證實(shí)具有顯著的療效和良好的安全性。然而因不可避免地會(huì)出現(xiàn)耐藥[2-3]，克服耐藥是亟需解決的難題。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)是靶向表觀遺傳的一類新型抑制劑，可通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡、抑制腫瘤血管生成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等抑制腫瘤生長(zhǎng)[4-5]。目前HDACI已在多種惡性腫瘤中應(yīng)用[6-8]。伏立諾他(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤，厄洛替尼是第一代治療NSCLC的EGFR-TKI，SAHA與厄洛替尼聯(lián)合應(yīng)用在NSCLC中的療效鮮有報(bào)道。H1975細(xì)胞含有T790M突變，對(duì)厄洛替尼耐藥，為尋求逆轉(zhuǎn)耐藥的新途徑，課題組開展此實(shí)驗(yàn)，前期的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[9]表明SAHA與厄洛替尼聯(lián)用具有協(xié)同作用，該實(shí)驗(yàn)主要研究SAHA與厄洛替尼聯(lián)用在動(dòng)物體內(nèi)是否具有協(xié)同作用并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株50只雌性Balb/c裸鼠，購自江蘇維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。合格證編號(hào)：NO201717625，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0003，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。人肺腺癌H1975細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑SAHA購自美國(guó)Target Molecule公司，按說明書配制成5 mg/ml的儲(chǔ)備液；厄洛替尼購自美國(guó)Target Molecule公司，按說明書配制成3 mg/ml的儲(chǔ)備液；RPIM 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國(guó)HyClone公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國(guó)Thermo Scientific公司；TUNEL試劑盒(POD法)購自美國(guó)Roche公司；GAPDH、Ki-67、AKT、p-AKT(Ser473)、ERK、p-ERK(Thr202/Tyr204)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)均購自美國(guó)CST公司；PV-6000通用型試劑盒、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) H1975細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1%青鏈霉素的RPIM 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d傳代1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需數(shù)量時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×107個(gè)/ml，待用。

1.3.2動(dòng)物建模及分組給藥 Balb/c裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲水，常規(guī)飲食。每只裸鼠右腋下注射H1975細(xì)胞0.1 ml，即5×106個(gè)細(xì)胞。每周測(cè)量腫瘤大小、體質(zhì)量2～3次，腫瘤體積計(jì)算公式：TV=1/2ab2,其中a為長(zhǎng)徑，b為短徑。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算相對(duì)腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，RTV=Vt/V0，其中V0為分組給藥前(即d0)的腫瘤體積，Vt為每次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)，即治療組RTV與對(duì)照組RTV比值的百分比(T/C=TRTV/CRTV×100%)，T/C>60%為無效，≤60%并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P<0.05為有效。待腫瘤體積達(dá)到100～300 mm3時(shí)，選取腫瘤大小均一性較好的荷瘤裸鼠，采用隨機(jī)分組法分為4組，每組8只：對(duì)照組(PBS)、SAHA組(SAHA 50 mg/kg)、厄洛替尼組(erlotinib 30 mg/kg)、聯(lián)合組(SAHA 50 mg/kg+erlotinib 30 mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥21 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，CO2窒息法處死裸鼠，剝離腫瘤組織并稱重，計(jì)算抑瘤率(TGI)(%)=(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%，TGI<40%為無效，≥40%并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P<0.05為有效。應(yīng)用金氏公式計(jì)算Q值評(píng)估兩藥聯(lián)用的效果，Q=1-EA+B/(EA+EB),EA+B表示兩藥聯(lián)用時(shí)的抑瘤率，EA和EB表示單藥時(shí)的抑瘤率。Q<0.85表示兩藥有拮抗作用，0.85≤Q≤1.15表示兩藥有相加作用，Q>1.15表示兩藥有協(xié)同作用。剝離的腫瘤組織部分固定于10%的中性福爾馬林中，部分凍存于液氮中，待做后續(xù)檢測(cè)。

1.3.3Western blot 取凍存于液氮中的腫瘤組織，預(yù)冷PBS洗2次，液氮中充分研磨后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(RIPA ∶蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)，冰上裂解30 min后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白樣品濃度，將蛋白樣品置于沸水浴中加熱15 min。每孔加30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶或5% BSA室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以GAPDH蛋白為內(nèi)參照，應(yīng)用Image J軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

1.3.4HE染色 取經(jīng)福爾馬林固定的腫瘤組織，經(jīng)脫水、包埋、切片，60 ℃溫箱烤片2 h，經(jīng)脫蠟水化處理后，蘇木精染色8 min，再?zèng)_洗、分化、返藍(lán)，伊紅染色數(shù)秒后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察腫瘤組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.3.5免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)染色 取經(jīng)福爾馬林固定的腫瘤組織，脫水、常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片、烤片，之后脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，3%的H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，一抗4 ℃孵育過夜，用已知陽性切片作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，二抗37 ℃孵育30 min后DAB染色、蘇木精復(fù)染，沖洗、分化、返藍(lán)，梯度酒精脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。以細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色或棕褐色為陽性反應(yīng)，每張片子選取5個(gè)隨機(jī)視野(×20)，用Image J軟件分析陽性細(xì)胞率。

1.3.6IHC和TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖率及凋亡率 用免疫組化法檢測(cè)Ki-67的表達(dá)情況；TUNEL的檢測(cè)按照試劑盒說明書具體操作步驟進(jìn)行。以細(xì)胞核染成棕黃色或棕褐色為陽性反應(yīng)，每張片子選取5個(gè)隨機(jī)視野(×20)，用Image J軟件分析增殖率/凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 SAHA聯(lián)合厄洛替尼對(duì)H1975裸鼠移植瘤大小、瘤重及體質(zhì)量的影響聯(lián)合組與對(duì)照組、SAHA組及厄洛替尼組比較，腫瘤大小及瘤重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.58、8.59，P<0.05)，而SAHA組、厄洛替尼組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T/C≤60%且TGI≥40%(P<0.05)，提示SAHA和厄洛替尼聯(lián)用對(duì)H1975肺癌移植瘤有抑制作用。兩藥聯(lián)用Q值為1.86，提示SAHA和厄洛替尼聯(lián)用有協(xié)同作用。見圖1、表1。

圖1 各組裸鼠第21天腫瘤大小

分組體質(zhì)量(g)0 d21 d腫瘤大小(mm3)0 d21 d相對(duì)腫瘤增殖率(%)瘤重(g)抑瘤率(%)對(duì)照18.0±0.319.4±0.6183±21 1 838±469100.00 2.41±1.020SAHA17.7±0.419.3±0.7183±17 1 669±428#90.81 2.11±0.69#12.45厄洛替尼18.3±0.320.0±0.6182±16 1 648±355#89.66 1.95±0.67#19.09聯(lián)合18.7±0.317.7±0.6183±17 1 061±205?57.73 1.10±0.30?54.36

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與聯(lián)合組比較：#P<0.05

圖2 Western blot檢測(cè)各組腫瘤組織中PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及相對(duì)表達(dá)量分析

A:Western blot檢測(cè)各組腫瘤組織中PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；B:Western blot檢測(cè)各組腫瘤組織中p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-ERK/ERK的相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.001；與聯(lián)合組比較：#P<0.05，##P<0.001

2.2 Western blot檢測(cè)各組移植瘤腫瘤組織中PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果表明，SAHA聯(lián)合厄洛替尼在不影響AKT、mTOR、ERK總蛋白表達(dá)的情況下，可顯著下調(diào)p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達(dá)，與單藥組及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.64、25.19、46.12，P<0.05)，提示SAHA聯(lián)合厄洛替尼可抑制PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK兩條信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的活化。見圖2。

2.3 IHC檢測(cè)各組移植瘤腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR和p-ERK的表達(dá)免疫組化結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，單用SAHA或厄洛替尼對(duì)H1975腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)，而SAHA聯(lián)合厄洛替尼卻能顯著抑制腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達(dá)(F=5.28、9.67、10.44，P<0.05)，且聯(lián)合組的抑制作用明顯優(yōu)于單藥組。見圖3。

2.4 SAHA聯(lián)合厄洛替尼對(duì)H1975裸鼠移植瘤腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織以輕中度壞死為主，SAHA組和厄洛替尼組以中重度壞死為主，而聯(lián)合組以重度壞死為主，可見細(xì)胞呈不同程度皺縮、胞質(zhì)致密、核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞核固縮、變性及裂解。各組移植瘤腫瘤細(xì)胞增殖率分別為:對(duì)照組(29.12±7.24)%，SAHA組(26.36±7.27)%，厄洛替尼組(27.15±3.40)%，聯(lián)合組(17.98±5.03)%；各組移植瘤腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為:對(duì)照組(2.35±1.25)%，SAHA組(6.39±1.79)%，厄洛替尼組(6.44±5.07)% ，聯(lián)合組(12.15±5.43)%。聯(lián)合組與對(duì)照組、SAHA組及厄洛替尼組相比，增殖率及凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.44、8.67，P<0.05)。見圖4。

圖3 IHC檢測(cè)各組腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR和p-ERK的表達(dá)及半定量分析×20

A:IHC檢測(cè)各組腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR和p-ERK的表達(dá); B:各組裸鼠腫瘤組織中p-AKT、p-mTOR、p-ERK陽性表達(dá)率；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.001；與聯(lián)合組比較：#P<0.05

3 討論

近年來肺癌的發(fā)生率和死亡率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，已躍居惡性腫瘤之首。腫瘤治療的三大傳統(tǒng)手段(手術(shù)、化療、放療)對(duì)于晚期肺癌療效甚微，分子靶向藥物EGFR-TKI的出現(xiàn)對(duì)NSCLC的治療具有里程碑的意義，然而無論近期療效如何，經(jīng)TKI治療后的肺癌患者最終都會(huì)不可避免地出現(xiàn)耐藥而導(dǎo)致治療失敗或疾病進(jìn)展。研究[10]表明獲得性耐藥中EGFR-T790M二次突變約占50%，c-Met基因擴(kuò)增約占15%～20%，其他不明原因約占30%。H1975細(xì)胞株的EGFR含有L858R和T790M雙突變，L858R是EGFR第21號(hào)外顯子發(fā)生了點(diǎn)突變，使858位密碼子的亮氨酸置換為精氨酸，是TKI治療的敏感突變；T790M是EGFR第20號(hào)外顯子發(fā)生了錯(cuò)義突變，使790位密碼子的蘇氨酸置換為甲硫氨酸，其中T790M突變是國(guó)際公認(rèn)的一代EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制。T790M突變導(dǎo)致側(cè)鏈空間結(jié)構(gòu)增大，出現(xiàn)位阻效應(yīng)，這種位阻效應(yīng)阻礙了EGFR-TKI與EGFR的結(jié)合，同時(shí)導(dǎo)致EGFR與ATP親和力增加，引起下游信號(hào)通路的持續(xù)活化，從而導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[11]。

圖4 各組裸鼠腫瘤組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及對(duì)增殖率和凋亡率的影響 ×20

A:各組裸鼠腫瘤組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及增殖和凋亡情況； B:各組裸鼠腫瘤組織Ki-67陽性表達(dá)率；C:各組裸鼠腫瘤組織TUNEL陽性表達(dá)率；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.001；與聯(lián)合組比較：#P<0.05

厄洛替尼通過競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合胞內(nèi)EGFR-TK催化區(qū)域的Mg-ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制激酶的自身磷酸化，阻斷EGFR下游信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用； HDACI是一類新型的抗腫瘤藥物，具有高效低毒的特點(diǎn)，其中SAHA是最具代表性的HDACI之一，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)[12]表明SAHA對(duì)EGFR突變的NSCLC細(xì)胞有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)建立了H1975肺癌裸鼠移植瘤模型，根據(jù)臨床前抗腫瘤藥效方法評(píng)價(jià)SAHA與厄洛替尼聯(lián)用的抗腫瘤藥效活性，結(jié)果表明SAHA聯(lián)合厄洛替尼可協(xié)同抑制H1975肺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，降低腫瘤大小和瘤重。免疫組化和TUNEL結(jié)果表明SAHA聯(lián)合厄洛替尼可協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Western blot和免疫組化結(jié)果表明SAHA聯(lián)合厄洛替尼可顯著下調(diào)p-AKT、p-mTOR、p-ERK的表達(dá)，提示兩藥聯(lián)用能同時(shí)抑制PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK兩條信號(hào)通路中相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)。

臨床上患者對(duì)EGFR-TKI耐藥的主要原因是EFRG下游信號(hào)通路磷酸化蛋白的持續(xù)活化[13]。EGFR的下游信號(hào)通路主要有兩條：PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK，這兩條信號(hào)通路也是目前研究最為深入的。PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK兩條信號(hào)通路能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、新陳代謝等過程，是細(xì)胞的關(guān)鍵生存信號(hào)通路, 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及化療耐藥性等相關(guān)。研究[14]表明，這兩條信號(hào)通路是相互作用的，抑制這兩條信號(hào)通路中的一條會(huì)導(dǎo)致另一條信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)激活，而同時(shí)抑制兩條信號(hào)通路卻能更有效地起到抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣也證實(shí)了這一點(diǎn)，SAHA聯(lián)合厄洛替尼能同時(shí)抑制這兩條信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的活化，抑制下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥。

綜上所述，SAHA聯(lián)合厄洛替尼可顯著抑制H1975肺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，作用機(jī)制可能與同時(shí)抑制PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK兩條信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的活化有關(guān)。SAHA聯(lián)合厄洛替尼能部分逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI耐藥，顯著增強(qiáng)在H1975裸鼠移植瘤中的療效，可能作為靶向增敏劑。本實(shí)驗(yàn)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在動(dòng)物體內(nèi)研究了SAHA聯(lián)合厄洛替尼的協(xié)同抑瘤作用及可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。