李 力，武明飛，余宏鑄

惡性腫瘤是嚴(yán)重影響人體健康和威脅人類生命的重要疾病之一，已成為人類死亡的第二個(gè)原因，也是最難治療的疾病之一。血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程。沒有血管生成，最大的腫瘤只能長(zhǎng)到1～2 mm，很容易使用傳統(tǒng)的化療藥物治療[1-2]。因此，通過(guò)阻斷腫瘤血管生成，已成為抑制腫瘤生長(zhǎng)的腫瘤治療新策略[3]。

小檗堿又稱黃連素，占黃連總生物堿的40%左右，屬于季銨型異喹啉類生物堿，是中藥黃連的主要生物堿，其含量高達(dá)5%～8%，不僅含量最高，且是其主要有效成分[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明小檗堿具有廣泛的藥理學(xué)作用，其中小檗堿作為抗腫瘤藥物的文獻(xiàn)已經(jīng)具有很多生藥學(xué)和臨床學(xué)的證據(jù)。研究[5]表明小檗堿能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡、抑制遺傳信息合成、阻滯細(xì)胞周期等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其在腫瘤防治方面具有潛在的應(yīng)用前景。課題組采用計(jì)算機(jī)反向虛擬篩選發(fā)現(xiàn)，小檗堿與腫瘤血管生成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)有良好的結(jié)合作用，因此推斷該小分子具有抗腫瘤血管生成的潛能。該研究為了驗(yàn)證這一推論，采用了EA.hy926細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC與肝癌細(xì)胞A549融合株)為模型，進(jìn)行了一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)小檗堿的抗血管生成作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試劑及來(lái)源 小檗堿、3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人抗體(PI3K、Akt、mTOR和P70S6K)購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；抗β-肌動(dòng)蛋白，磷酸特異性抗體[抗Akt(Ser 473)、抗mTOR(Ser2448)和抗-P70S6K(Thr 389)]、VEGFR2蛋白、VEGFR2酶ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；TRIzol試劑、蛋白酶抑制劑混合物購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液、培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與肺癌細(xì)胞A549融合株EA.hy926細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1反向找靶及分子對(duì)接 采用Discovery Studio 2017R2進(jìn)行反向找靶。配體首先使用DS 2017 R2進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，隨后對(duì)蛋白和配體進(jìn)行加氫和電荷，最后采用Discovery Studio 2017R2對(duì)接程序進(jìn)行分子對(duì)接及分析結(jié)果。根據(jù)反向?qū)咏Y(jié)果，選擇VEGFR2(PDB號(hào)：3vid)為潛在靶點(diǎn)，使用Libdock程序進(jìn)行再次對(duì)接，并分析配體與蛋白之間的作用模式。所有蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.2表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)(surface plasmon resonance,SPR)實(shí)驗(yàn) 采用GE Biacore T200生物大分子相互作用分析儀進(jìn)行操作。首先將生物素(100 nmol/L)標(biāo)記的VEGFR2固定在帶有鏈親和素標(biāo)記的芯片上。其次將6種不同濃度的小檗堿溶液以20 μl/min 的速度流過(guò)芯片，整個(gè)過(guò)程持續(xù)5 min；化合物和蛋白結(jié)合后，再用緩沖液沖洗10 min，最后用Biacore T200分析軟件2.1分析結(jié)果。

1.2.3酶活性測(cè)試實(shí)驗(yàn) 按照VEGFR2 ELISA試劑盒的說(shuō)明書操作。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng) 在補(bǔ)充有10%胎牛血清和鏈霉素/青霉素(100 U/ml)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)EA.hy926細(xì)胞。

1.2.5MTT實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞鋪在96孔板中，培養(yǎng)24 h后，與各種濃度的小檗堿(0、5、10、20、40、80 μmol/L)在37 ℃共孵育48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)繼續(xù)孵育4 h，然后將DMSO(100 μl/孔)加入到每孔中，震蕩，在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。所有的測(cè)量結(jié)果一式三份。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn) EA.hy926在6孔板中長(zhǎng)滿單層后，用移液槍槍頭在細(xì)胞底層劃一條直線，棄去培養(yǎng)基，用100×放大倍數(shù)的顯微鏡拍照記錄，然后加入含有不同濃度小檗堿的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，再次拍照記錄，計(jì)算遷移率。所有實(shí)驗(yàn)操作3次。

1.2.7雞胚絨毛尿囊膜 (chick embryo chorioallantoic membrane, CAM)膜實(shí)驗(yàn) 取孵育8 d的雞胚，在氣室端開一個(gè)1 cm×1 cm的小孔，將配制好的含有不同濃度的小檗堿的小紙片(半徑2.5 mm)貼在血管較少部位，封閉，37 ℃溫箱中無(wú)菌培養(yǎng)3 d后將雞胚轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱中凍存，24 h后剝離CAM，平鋪，拍照，記錄結(jié)果。

1.2.8Western blot實(shí)驗(yàn) 不同濃度的小檗堿與EA.hy926細(xì)胞共孵育48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BAC法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將將漂洗后的凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后將膜在室溫下用5%脫水脫脂牛奶封閉膜2 h。之后TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min。然后將轉(zhuǎn)好的PVDF膜與一抗在4 ℃中溫育過(guò)夜。隨后在室溫下加入與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的二抗(山羊抗兔IgG-HRP抗體)1 h。未結(jié)合抗體用TBST洗滌3次，每次15 min。最后使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑將印跡中的特定蛋白質(zhì)可視化，最后用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 反向找靶針對(duì)Discovery studio 2017R2自帶的藥物靶點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)反向虛擬篩選，結(jié)果顯示小檗堿能夠結(jié)合多種靶點(diǎn)(圖1)，其結(jié)合能力用契合值表示，契合值越大，結(jié)合能力越強(qiáng)。取打分前十的結(jié)果分析(表1)，結(jié)果顯示小檗堿能夠與VEGFR2的產(chǎn)生良好的結(jié)合作用，提示VEGFR2可能是小檗堿的重要靶點(diǎn)之一。

圖1 Discovery Studio 2017R2分析預(yù)測(cè)小檗堿的蛋白質(zhì)靶標(biāo)

表1 Discovery Studio 2017R2預(yù)測(cè)的排名前十位的蛋白質(zhì)靶標(biāo)

分子對(duì)接分析了小檗堿與VEGFR2的結(jié)合模式。如圖2所示，小檗堿能夠通過(guò)多重作用結(jié)合到VEGFR2的活性位點(diǎn)，結(jié)合方式包括分之間氫鍵、與芳香氨基酸殘基之間的Π-Π堆積作用、p-Π堆積作用等。這一結(jié)果提示了小檗堿與VEGFR2結(jié)合契合值高的原因。

圖2 小檗堿與VEGFR2(PDB號(hào)：3vid)的結(jié)合模式圖

A：小檗堿插入VEGFR2活性位點(diǎn)的三維圖；B：VEGFR2活性位點(diǎn)與小檗堿相互作用的氨基酸殘基；C：VEGFR2活性位點(diǎn)的氨基酸殘基與小檗堿相互作用的二維模式圖

2.2 小檗堿與VEGFR2良好的結(jié)合作用并顯著抑制VEGFR2激酶的活性為進(jìn)一步證實(shí)小檗堿與VEGFR2的結(jié)合作用，本研究開展SPR實(shí)驗(yàn)。過(guò)程如圖3所示，圖中的6條線代表不同濃度的小檗堿與VEGFR2的結(jié)合情況。分析結(jié)果顯示，小檗堿對(duì)VEGFR2的結(jié)合常數(shù)KD值達(dá)到0.652 64 μmol/L，說(shuō)明小檗堿在體外與VEGFR2有良好的結(jié)合作用。

圖3 SPR 法測(cè)定小檗堿與VEGFR2蛋白的結(jié)合作用

酶抑制實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了小檗堿對(duì)VEGFR2激酶活性的抑制作用。結(jié)果如圖4所示，小檗堿對(duì)VEGFR2激酶活性的抑制作用呈劑量依賴性。相對(duì)于空白對(duì)照組，在8 μmol/L濃度時(shí)酶活性抑制率即達(dá)到50 %以下，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.63,P=0.001 7)。經(jīng)擬合得到酶抑制活性半數(shù)抑制濃度(IC50)值為(5.48±0.37)μmol/L，其數(shù)量級(jí)與陽(yáng)性對(duì)照藥物Semaxanib(IC50)=(1.67±0.16) μmol/L相當(dāng)。

2.3 小檗堿抑制EA.hy926的增殖與遷移MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小檗堿對(duì)EA.hy926有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒性，IC50值為(15.18±1.04) μmol/L?；谶@一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在非毒性濃度條件下，評(píng)價(jià)了小檗堿抑制EA.hy926的遷移作用。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，相對(duì)于空白對(duì)照組，5 μmol/L濃度的小檗堿干預(yù)24 h后，EA.hy926細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制，相對(duì)遷移率下降到(62.13±2.34)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.988,P=0.039)，且這種抑制作用隨小檗堿濃度的增加而增強(qiáng)，在10 μmol/L濃度時(shí)，相對(duì)遷移率下降到(41.64±3.71)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.38,P=0.016)。

2.4 小檗堿對(duì)CAM血管生成的抑制作用與空白對(duì)照組(使用0.9% NaCl溶液作為空白對(duì)照)比較，小檗堿可顯著抑制新血管增殖，顯示出明顯的抗血管生成活性。如圖6所示，小檗堿10 μmol/L濃度組在載樣濾紙片周圍表現(xiàn)出血管網(wǎng)分布稀少、分叉程度低的結(jié)果，而陰性對(duì)照組的血管網(wǎng)表現(xiàn)出血管分布均勻、粗大、形成多級(jí)分叉的現(xiàn)象；20 μmol/L濃度組則顯示出更為顯著的抗血管生成活性。除此之外，測(cè)試物濾紙片周圍血管顏色鮮紅，說(shuō)明測(cè)試物沒有影響原有血管的活性。由此可見，小檗堿在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度越大，小檗堿的抗血管生成活性越明顯。

圖4 小檗堿和Semaxanib對(duì)VEGFR2激酶的抑制作用

A：小檗堿對(duì)VEGFR2激酶酶活抑制曲線；B：Semaxanib對(duì)VEGFR2激酶酶活抑制曲線；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.5 小檗堿抑制EA.hy926中VEGFR2介導(dǎo)的Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)傳導(dǎo)的活化小檗堿與EA.hy926作用24 h后能夠顯著抑制VEGFR2下游信號(hào)分子如Akt、mTOR和P70S6K的激活(圖7)，這表明小檗堿通過(guò)結(jié)合制EA.hy926細(xì)胞表面的VEGFR2從而阻斷其介導(dǎo)的Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)抑制血管生成。

圖5 小檗堿對(duì)EA.hy926細(xì)胞遷移能力的影響

A: 0、5、10 μmol/L濃度條件下細(xì)胞遷移結(jié)果；B:相對(duì)遷移率；與0 μmol/L小檗堿組比較：*P<0.05

3 討論

小檗堿作為黃連主要活性成分被證明是其清熱燥濕，瀉火解毒等功效的主要成分；現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，小檗堿不僅在抗菌消炎、抗腸道細(xì)菌感染等傳統(tǒng)藥效方面發(fā)揮作用，而且在心血管系統(tǒng)疾病治療、高脂血癥及癌癥等方面的治療也表現(xiàn)出較好的生物活性，具有潛在的廣泛應(yīng)用價(jià)值[4-6]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)小檗堿進(jìn)行了大量、深入的研究，不僅實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的生物合成，而且通過(guò)對(duì)該類化合物的結(jié)構(gòu)改造和修飾合成了一系列衍生物，并進(jìn)行了相關(guān)的藥理活性測(cè)試，證實(shí)小檗堿能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制其細(xì)胞增殖，其中包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌等[4-5]。關(guān)于小檗堿抗腫瘤細(xì)胞的機(jī)制研究報(bào)道雖多，但是深入研究的并不多。對(duì)傳統(tǒng)藥物靶點(diǎn)篩選的方式通常是盲目，這種方法耗時(shí)耗力，急需引入一種快捷的尋靶方式。反向虛擬篩選是一種對(duì)給定藥物或活性小分子通過(guò)計(jì)算方法找到其潛在藥物靶標(biāo)的技術(shù)?？梢杂糜诨衔锇袠?biāo)確證、藥物新作用研究、藥物毒副作用研究。本研究采用反向虛擬篩選技術(shù)觀察了小檗堿對(duì)Discovery Studio 2017自帶的藥效團(tuán)模型數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)合作用。結(jié)果顯示，在海量的靶點(diǎn)中，小檗堿與VEGFR2有良好的結(jié)合作用，其結(jié)合模式通過(guò)分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了解析，結(jié)果顯示小檗堿能夠多重作用結(jié)合到VEGFR2的活性位點(diǎn)。SPR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和酶抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了小檗堿與VEGFR2有良好的結(jié)合及酶活抑制作用。

圖6 CAM實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果A～D：0、5、10、20 μmol/L小檗堿

圖7 小檗堿抑制EA.hy926細(xì)胞中Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路的激活

在腫瘤血管新生過(guò)程中，許多信號(hào)通路起到重要作用，VEGF信號(hào)通路尤為重要。VEGFR2作為VEGF信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，已成為許多抗腫瘤血管生成藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)[7]。鑒于小檗堿與VEGFR2的良好結(jié)合作用，推斷小檗堿具備抗腫瘤血管生成的能力。為了驗(yàn)證這一推論，在體內(nèi)外評(píng)價(jià)了小檗堿抑制血管生成的作用。研究結(jié)果顯示，小檗堿對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與肺癌細(xì)胞A549融合細(xì)胞株EA.hy926的增殖有明顯的抑制作用，IC50值為(15.18±1.04) μmol/L，其作用機(jī)制可能是細(xì)胞毒性作用，或是影響細(xì)胞周期從而影響細(xì)胞增殖，但具體的作用環(huán)節(jié)仍不清楚，有待進(jìn)一步的研究。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是血管新生的重要環(huán)節(jié)[8]，在本研究中采用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了藥物干預(yù)下EA.hy926細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，小檗堿能夠顯著抑制EA.hy926 細(xì)胞的遷移，且呈劑量依賴性，表明小檗堿對(duì)EA.hy926細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)有明顯的抑制作用。CAM法是篩選血管新生抑制劑的一種簡(jiǎn)便、快捷的方法，CAM的血管生成早期，機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未完全建立，因此CAM對(duì)各種異物幾乎不發(fā)生排斥反應(yīng)，便于將含有藥物的載體置于其表面，觀察藥物對(duì)血管生成的影響[9-10]。為進(jìn)一步驗(yàn)證小檗堿的體內(nèi)抗血管生成能力，使用不同劑量的藥物干預(yù)了CAM上小血管的生成。結(jié)果顯示與空白對(duì)照比較，給藥組的CAM表面血管的生成明顯受到抑制，且藥物濃度越高抑制作用越明顯，且測(cè)試物濾紙片周圍血管顏色鮮紅，含血液，說(shuō)明小檗堿沒有毒死原有的血管，而是抑制了血管的新生。此外，VEGFR2所介導(dǎo)的Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)傳導(dǎo)最近被確定為新的血管生成功能介質(zhì)[11-12]，該信號(hào)通路的活化是導(dǎo)致腫瘤血管新生的重要機(jī)制[13]。用小檗堿干預(yù)EA.hy926細(xì)胞后，mTOR和P70S6K及其上游激酶Akt的磷酸化急劇下降，表明小檗堿可通過(guò)結(jié)合VGEFR2阻斷其多個(gè)下游信號(hào)傳導(dǎo)成分來(lái)抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，小檗堿能夠結(jié)合VEGFR2，抑制VEGFR2的活性，阻斷VEGFR2介導(dǎo)的Akt/mTOR/P70S6K信號(hào)通路，抑制EA.hy926細(xì)胞的增殖與遷移，抑制CAM表面血管的生成，具有顯著的抗血管生成的活性作用。這些結(jié)果提供了對(duì)小檗堿的抗血管生成作用涉及的機(jī)制的理解，并突出其抗癌潛力，為以后抗癌機(jī)制和抗癌藥物的發(fā)展和研制提供了一個(gè)全新思路。