孫曉穎 鄺斌 羅志建 李明星

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腹部超聲醫(yī)學(xué)科（四川瀘州646000）

腎臟缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是指腎臟在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流灌注后組織損傷不緩解，甚至加重發(fā)生不可逆損傷的一種病理現(xiàn)象，主要發(fā)生于心血管手術(shù)、腎移植、腎部分切除術(shù)后等手術(shù)過(guò)程中，是造成急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的重要原因，具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。因此如何早期發(fā)現(xiàn)缺血再灌注引起的腎損傷及監(jiān)測(cè)腎功能的變化一直是臨床研究的熱點(diǎn)。地塞米松（dexamethasone，Dexa）是一種強(qiáng)有效的皮質(zhì)類固醇激素，具有強(qiáng)大的抗炎、抗免疫和抗風(fēng)濕作用，既往相關(guān)研究表明其可以減輕RIRI［2-4］，但少有研究報(bào)道應(yīng)用超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）技術(shù)來(lái)評(píng)估其對(duì)RIRI微循環(huán)的影響。本實(shí)驗(yàn)擬用CEUS分析體外給予地塞米松后，腎皮質(zhì)血流時(shí)間-強(qiáng)度曲線（time-intensity curve，TIC）各參數(shù)的變化，目的是探究TIC曲線中各參數(shù)在評(píng)估藥物治療RIRI的臨床意義，以期為臨床治療RIRI提供一種有效的監(jiān)測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組健康雄性SD大鼠18只（體質(zhì)量200～250 g、由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），術(shù)前所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水，將所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、地塞米松藥物組（Dexa組）3組，每組各6只。Dexa組術(shù)前1 h給予地塞米松（4 mg/kg）腹腔注射給藥，Sham組與I/R組術(shù)前給予等量的0.9%的生理鹽水腹腔注射給藥。

1.2 動(dòng)物模型的建立10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（2 mL/kg，規(guī)格1 mL：100 mg），術(shù)前二維超聲定位雙側(cè)腎臟位置，雙腎區(qū)剃毛，碘伏消毒，大鼠俯臥位，行縱行切口，逐層分離，游離輸尿管，用2.0 mm的手術(shù)線結(jié)扎大鼠腎蒂后切除右側(cè)腎臟，左側(cè)腎蒂使用無(wú)損傷血管夾夾閉45 min，根據(jù)左腎顏色來(lái)判斷缺血情況，腎臟由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色，表明缺血成功，45 min后松開血管夾進(jìn)行再灌注，待腎臟由暗紅色轉(zhuǎn)為鮮紅色，恢復(fù)血液供應(yīng)后再將其還納至腹腔并縫合切口，假手術(shù)組僅切除右腎并分離左側(cè)腎蒂，不進(jìn)行鉗夾處理。術(shù)后自由進(jìn)食飲水。

1.3 超聲造影檢查所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后24 h麻醉、固定。選取西門子ACUSON S3000超聲診斷儀9L4變頻線陣探頭，在普通二維超聲下觀察腎臟的大小及血流灌注，然后取大鼠左側(cè)腎臟最大冠狀切面，固定探頭，進(jìn)入造影模式，設(shè)定相關(guān)超聲造影參數(shù)：頻率4.0 MHz、深度4 cm，機(jī)械指數(shù)MI0.1，Sonovue（上海博萊科信誼有限責(zé)任公司包裝，BRACC0 Imaging，B.V 公司生產(chǎn)），規(guī)格：59 mg六氟化硫，25 mg，按說(shuō)明將凍干粉注入生理鹽水5 mL，配置成微泡懸液，按0.4 mL/kg的劑量，抽取震蕩混勻后的造影劑，經(jīng)大鼠尾靜脈快速注射，隨后注射0.2 mL的生理鹽水沖洗，啟動(dòng)超聲儀內(nèi)置計(jì)時(shí)器，同步采集并保存動(dòng)態(tài)影像3 min，運(yùn)用西門子公司所提供的隨機(jī)攜帶的（Auto tracking contrast quantification，ACQ）定量分析軟件分析，將感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）面積0.05 mm2的圓形，放置于腎最大冠狀截面中央的外層皮質(zhì)，繪制TIC曲線，觀察和分析如下參數(shù)：達(dá)峰濃度（Peak），達(dá)峰時(shí)間（TP），曲線下面積（AUC），平均渡越時(shí)間（MTT）。所有參數(shù)測(cè)量3次取均值以減少誤差。

1.4 腎功能的檢測(cè)超聲造影結(jié)束后，取大鼠下腔靜脈血2.0 mL，室溫離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，送西南醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)科，對(duì)血肌酐（Crea）及尿素（Urea）進(jìn)行生化檢測(cè)。

1.5 腎臟病理檢測(cè)取血結(jié)束后，處死大鼠，快速摘取大鼠左側(cè)腎臟，切取1/2腎臟組織，用10%的中性甲醛固定，行石蠟包埋，取石蠟切片后行HE染色，送于西南醫(yī)科大學(xué)病理科進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0用于統(tǒng)計(jì)描述與推斷，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，當(dāng)P＜0.05，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎皮質(zhì)超聲造影TIC曲線經(jīng)大鼠尾靜脈團(tuán)注超聲造影劑后，可以觀察到正常大鼠的腎臟按腎動(dòng)脈（腎動(dòng)脈主干、段動(dòng)脈、葉間動(dòng)脈、弓形動(dòng)脈）、腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)的順序依次明顯增強(qiáng)，呈“火球樣改變”，迅速達(dá)到峰值強(qiáng)度后按腎髓質(zhì)、腎皮質(zhì)、腎動(dòng)脈的順序緩慢下降至基礎(chǔ)水平。分析感興趣區(qū)域，可見Sham組（圖1A）TIC曲線上升陡直，迅速達(dá)峰后，又快速下降，腎臟缺血再灌注損傷后，腎功能受損，腎臟血流動(dòng)力學(xué)出現(xiàn)障礙，腎臟I/R組（圖1B）TIC曲線表現(xiàn)為上升和下降均減慢。較腎臟I/R組相比較，預(yù)先注射地塞米松后，Dexa組（圖1C）腎臟血流動(dòng)力學(xué)障礙得到改善，TIC曲線上升和下降過(guò)程有所增快，但較Sham組相比較，仍較緩慢。

圖1 各組大鼠腎臟皮質(zhì)血流灌注TIC曲線Fig.1 The TIC curve of renal cortical perfusion in rats

2.2 腎皮質(zhì)TIC曲線各參數(shù)分析應(yīng)用單因素方差分析的方法比較各組之間Peak、TP、AUC、MTT值有無(wú)差異，分析結(jié)果顯示：I/R組、Dexa組相比較，Peak值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Sham、I/R、Dexa 3組TP、AUC、MTT值相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），分析結(jié)果顯示TIC曲線Peak值的變化不能完全反映腎皮質(zhì)血流灌注的變化情況，見表1。

表1 各組腎皮質(zhì)TIC曲線參數(shù)相比較Tab.1 Comparison of parameters of renal cortex TIC curve in each group x±s

2.3 地塞米松減輕缺血再灌注損傷腎臟的病理學(xué)改變?yōu)榱俗C實(shí)上述結(jié)果，觀察了腎臟組織切片病理改變。觀察發(fā)現(xiàn)，與Sham組（圖2A）相比，腎臟缺血再灌注損傷24 h后腎損傷明顯。腎臟I/R組表現(xiàn)為腎小管擴(kuò)張，輪廓欠清，胞漿內(nèi)空泡形成，以氣球樣變性為主，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，腎間質(zhì)充血、水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯（圖2B）。與之相反，觀察Dexa組腎組織病理切片發(fā)現(xiàn)腎小球輕度淤血，腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹，間質(zhì)輕度水腫（圖2C），說(shuō)明地塞米松的處理可以減輕腎臟病理學(xué)損傷。

圖2 各組大鼠腎臟病理學(xué)形態(tài)（HE×200）Fig.2 Kidney pathological morphology of rats in different groups（HE × 200）

2.4 地塞米松減輕腎缺血再灌注損傷與Sham組相比，腎臟I/R組Crea水平（69.33±12.02）μmol/L約是Sham組水平的3倍，Urea水平（29.11±6.08）mmol/L約是Sham組水平的4倍，表明腎臟缺血再灌注損傷后，腎功能下降（P＜0.05）。與腎臟I/R組相比，Dexa組Crea（41.10± 7.83）μmol/L及Urea水平（14.18±1.28）mmol/L均低于腎臟I/R組，提示地塞米松的使用使腎功能有所好轉(zhuǎn)，見表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用CEUS技術(shù)監(jiān)測(cè)地塞米松治療大鼠RIRI后的療效，進(jìn)一步證明了地塞米松可以減輕大鼠RIRI。與腎臟I/R組相比，地塞米松的使用降低了血Crea、Urea的水平，減輕了腎臟組織病理?yè)p傷，超聲造影腎皮質(zhì)TIC曲線中TP、MTT、AUC值也表現(xiàn)出了與此一致的變化。

表2 各組生化指標(biāo)的比較Tab.2 comparison of biochemical indexes in each group x±s

現(xiàn)在我國(guó)批準(zhǔn)上市的超聲造影劑聲諾維（Son-oVue）的主要化學(xué)成分為脂質(zhì)鞘包裹的六氟化硫微泡，是一種理想的血流示蹤劑，能夠隨血液流動(dòng)分布至全身，不會(huì)溢出至組織間隙或尿液內(nèi)，隨呼吸運(yùn)動(dòng)經(jīng)肺排出，不具有腎毒性，且不會(huì)影響被檢查系統(tǒng)［5-6］。通過(guò)分析計(jì)算感興趣區(qū)域（Region of interest，ROI）造影劑強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況，生成TIC曲線，同時(shí)分析軟件還可根據(jù)稀釋規(guī)律的GAMMA擬合曲線對(duì)TIC曲線進(jìn)行回歸性分析，得到峰值強(qiáng)度（Peak）、達(dá)峰時(shí)間（TP）、平均渡越時(shí)間（MTT）、曲線下面積（AUC）等，以量化的方式反映了器官組織內(nèi)毛細(xì)血管的實(shí)時(shí)血流特點(diǎn)。因此超聲造影技術(shù)被廣泛的應(yīng)用臨床，包括對(duì)腎臟、肝臟、胰腺、脾臟、乳腺、甲狀腺及睪丸等疾病的診斷及療效評(píng)估中。研究表明，很多腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都與血流灌注的改變相關(guān)，其中腎皮質(zhì)血流灌注約占整個(gè)腎臟的90%，因此選擇腎皮質(zhì)作為感興趣區(qū)域可以反映出整個(gè)血流腎臟的血流灌注情況。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)TIC曲線中的定量參數(shù)所反映的腎臟血流灌注變化通常早于患者生化檢驗(yàn)中的血肌酐和血尿素氮所反映的腎功能變化［7］。

地塞米松是一種常用的糖皮質(zhì)激素，研究證明其可以減輕許多器官的缺血再灌注損傷，如腦、心臟、腎臟，肺、腸道及止血帶引起小鼠后肢急性缺血再灌注損傷等［8］。其保護(hù)機(jī)制可能是由于以下原因：（1）糖皮質(zhì)激素的受體廣泛的分布于在肺、肝臟、腎臟及其他器官中，當(dāng)皮質(zhì)激素與其受體結(jié)合后，復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)迅速找到DNA上特異的結(jié)合位點(diǎn)并與之結(jié)合從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，誘導(dǎo)或阻止特異蛋白的合成發(fā)揮其藥理效應(yīng)；（2）其可以穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少炎癥因子及介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，減輕局部炎癥反應(yīng)；（3）地塞米松還可以抑制中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，防止微血栓阻塞毛細(xì)血管，改善微循環(huán)以解決再灌注時(shí)的無(wú)復(fù)流現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注24 h后腎臟血流動(dòng)力學(xué)出現(xiàn)明顯改變，本實(shí)驗(yàn)中Peak值Dexa＞I/R＞sham組，其中I/Rvs.Dexa組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這與羅志建等［9］所得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，原因可能為Peak所表示感興趣區(qū)域中造影劑增強(qiáng)達(dá)到峰值時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度，是瞬時(shí)的，累計(jì)效應(yīng)不明顯，因此Peak值不能完全作為反映腎皮質(zhì)血流灌注的定量指標(biāo)。腎臟I/R 24 h后，TP、MMT延長(zhǎng)，AUC增加，其中TP是指超聲造影劑開始進(jìn)入腎皮質(zhì)至達(dá)到最大強(qiáng)度的時(shí)間，MTT表示造影劑開始增強(qiáng)時(shí)間至峰值濃度下降一半的時(shí)間，反映了造影劑的灌注速度和廓清速度。RIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)是被廣泛認(rèn)可的一種機(jī)制［10］，缺血缺氧導(dǎo)致血管反應(yīng)性的收縮、內(nèi)皮細(xì)胞及各種炎癥因子的浸潤(rùn)、瘀滯，微循環(huán)血栓的形成，導(dǎo)致腎皮質(zhì)血流速度的減低，表現(xiàn)為造影劑灌注速度與廓清速度的減低，在TIC曲線中表現(xiàn)為MTT、TP的延長(zhǎng)。AUC反映的是在一定時(shí)間內(nèi)所選取ROI的累積效應(yīng)，RIRI血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，大量炎性細(xì)胞瘀滯于微血管和間質(zhì)中，炎性細(xì)胞對(duì)造影劑有一定的吞噬作用，使被吞噬的微泡繼續(xù)保留聲學(xué)活性，最終形成造影增強(qiáng)的累積效應(yīng)，使AUC增加。外源性給予地塞米松后，MMT、TP時(shí)間縮短，AUC減低，分析原因可能是地塞米松減緩了炎癥介質(zhì)的釋放及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低微循環(huán)阻力，改善腎皮質(zhì)血流灌注速度，表現(xiàn)為造影劑的灌注和廓清速度加快，因此在TIC曲線中表現(xiàn)為TP、MMT的縮短。炎癥的抑制使炎癥細(xì)胞對(duì)微泡的吞噬量減少，一定時(shí)間內(nèi)造影微泡累積量減少，在TIC曲線上表現(xiàn)為AUC的減少。

既往研究證明CEUS技術(shù)在評(píng)價(jià)移植腎術(shù)后血管并發(fā)癥、腎實(shí)質(zhì)占位的鑒別、腎腫瘤的治療及術(shù)后隨訪、慢性腎病、梗阻性腎病中都有一定的價(jià)值和較高的敏感性［11-12］。圍手術(shù)期由缺血再灌注損傷的引起的AKI是一種常見且具有破壞性的并發(fā)癥，并常常并發(fā)呼吸衰竭、敗血癥和多器官功能障礙綜合征，目前并沒有一種有效的特定的治療方法［13］。因此目前CEUS技術(shù)在臨床評(píng)價(jià)藥物治療RIRI研究相對(duì)較少，且超聲造影TIC曲線中各參數(shù)在評(píng)價(jià)藥物改善腎實(shí)質(zhì)血流灌注中尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，仍需要進(jìn)一步的研究。因此本實(shí)驗(yàn)用CEUS技術(shù)評(píng)價(jià)地塞米松治療大鼠RIRI后微循環(huán)的變化，并初步探討了TIC曲線中各參數(shù)的參考價(jià)值，具有一定的創(chuàng)新性。但實(shí)驗(yàn)仍存在以下不足：（1）樣本量相對(duì)較少；（2）研究范圍較為局限，只選取了24 h一個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為研究；（3）超聲造影觀察和分析的是一個(gè)二維切面，并不能完全代表腎臟的整體情況，有待向三維立體超聲造影方向發(fā)展。下一步研究將擴(kuò)大研究樣本量及研究范圍，進(jìn)一步探討TIC曲線中各參數(shù)的參考價(jià)值，以期為臨床上藥物治療RIRI的療效監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

綜上所述，超聲造影技術(shù)TIC曲線中TP、MMT、AUC等指標(biāo)在監(jiān)測(cè)和評(píng)估藥物改善大鼠腎缺血再灌注損傷中的具有較大的參考價(jià)值。腎缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，若想進(jìn)一步為臨床治療提供一個(gè)有效的診斷信息，則還需要大量實(shí)驗(yàn)研究，因此超聲造影技術(shù)有著巨大的研究前景，有待進(jìn)一步的研究。