鐘宋，劉玉元，劉樹人，周國柱，劉崇文，歐陽石

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球大約有2.4億人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），每年約有35萬人因HBV感染導(dǎo)致的肝衰竭、肝硬化或肝癌而死亡[1，2]。免疫功能紊亂是影響乙型肝炎患者病情轉(zhuǎn)歸的重要因素[3，4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，以自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）和樹突狀細(xì)胞為主的非特異性免疫反應(yīng)在HBV感染后參與抗原提呈和免疫清除等過程，在機(jī)體抵抗病毒感染、介導(dǎo)非特異性和特異性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。G2D是NK細(xì)胞觸發(fā)受體，為II型跨膜蛋白，含有胞外C型凝集素，可以取代其他細(xì)胞毒受體進(jìn)而激活NK細(xì)胞毒，以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。G2D可表達(dá)于NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞和某些病理條件下的CD4+T細(xì)胞[6]。近年來，NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒在肝損傷過程中的作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的重視。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HBV感染所致肝衰竭患者外周血NKG2D水平升高，但是NK細(xì)胞毒作用和殺傷活性則有所下調(diào)[7]。HBV可能通過下調(diào)NKG2D配體的表達(dá)而逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視[8]。就我們所知，既往很少有研究報道不同免疫狀態(tài)下的慢性乙型肝炎（CHB）患者NKG2D表達(dá)水平變化及其臨床意義。本研究檢測了慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者和肝衰竭患者血清和肝組織NKG2D表達(dá)水平，旨在探討NKG2D表達(dá)情況及其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年7月～2018年7月我院收治的慢性HBV攜帶者20例，男性11例，女性9例，平均年齡為（36.7±9.0）歲；慢性乙型肝炎患者18例，男性10例，女性8例，平均年齡為（35.9±9.3）歲；慢加急（亞急性）乙型肝炎肝衰竭患者16例，男性9例，女性7例，平均年齡為（36.3±8.8）歲。診斷符合2015年中華醫(yī)學(xué)會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[9]和《肝衰竭診治指南》[10]。排除其他類型的病毒性肝炎、自身免疫性肝病、嗜酒、藥物性肝損傷、妊娠和哺乳期婦女。另選健康體檢者20例，男性11例，女性9例，平均年齡為（37.0±9.5）歲。四組人群在性別和年齡方面無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。受試者簽署知情同意書。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 外周血NK細(xì)胞及血清穿孔素（PFP）和顆粒酶B水平檢測 采集 EDTA抗凝的新鮮靜脈血8 ml，充分混勻，在6 h內(nèi)采用聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H，華精生物高科技有限公司，中國上海）密度梯度離心法得到外周血單個核細(xì)胞（PBMC）。將PBMC凍存液加入PBMC中混勻，每管0.6～0.8 mL，置于凍存管中，并于-80℃冰箱中凍存。將已分離凍存的PBMC于37℃水浴解凍后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×1016/L，將細(xì)胞置于96孔板培養(yǎng)，5 d后取培養(yǎng)的細(xì)胞懸濁液，加入抗CD16+/CD56+和抗CD3/PE抗體（BD公司），進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選。將分選后的細(xì)胞懸濁液繼續(xù)培養(yǎng)：取培養(yǎng)3 d的已分選細(xì)胞，用 RPMI1640（Millipore，USA）洗滌 1 次，1100 r/m（r=18 cm）離心 4 min，用 RPMI1640 3 mL重懸細(xì)胞，置于6孔板，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)2 h后，經(jīng)濾網(wǎng)過濾，PBS洗滌 2次，1000 r/m（r=18cm）離心10 min，加入抗hNKG2D-APC（BD公司），室溫避光孵育30 min，加入PBS 1 mL洗滌，1000 r/m（r=18cm）離心 10 min，棄上清，加入10 g/L多聚甲醛溶液200μL固定細(xì)胞，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞分選儀（BDInflux，美國）檢測。通過酶標(biāo)儀（BioRad450，美國）采用ELISA法檢測血清PFP和顆粒酶B水平（武漢博士德生物有限公司）。

1.3 肝穿刺 所有病例經(jīng) B超檢查，在超聲引導(dǎo)下行肝穿刺 活檢，經(jīng)超聲波定位后，在局部麻醉下，用16 G穿刺針采用1秒鐘快速穿刺活檢法，取長約1.5～2.0 cm肝組織。正常肝組織取自在本院手術(shù)切除的肝血管瘤旁肝組織。采用熒光定量PCR法檢測肝組織NK G2D mRNA水平，采用Western bloting法檢測肝組織NK G2D蛋白表達(dá)水平，蛋白表達(dá)水平為目的蛋白條帶恢度與內(nèi)參（GAPDH）的比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以“±s”表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；樣本率的比較采用x2檢驗或Fisher精確概率計算；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組血生化、血清和病毒學(xué)指標(biāo)比較 見表1。

2.2 四組外周血單個核細(xì)胞百分比及血清穿孔素和顆粒酶B水平比較 CHB和肝衰竭患者NK細(xì)胞和G2D NK細(xì)胞百分比及血清學(xué)指標(biāo)均顯著高于HBV 攜帶者（P＜0.05，表2）。

表1 四組血生化、血清和病毒學(xué)指標(biāo)（±s）比較

表1 四組血生化、血清和病毒學(xué)指標(biāo)（±s）比較

與 HBV 攜帶者比，①P＜0.05；與 CHB 組比，②P＜0.05

例數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBVDNA（lgU/ml） HBeAg（mIU/ml）HBV攜帶者 20 28.6±6.1 42.3±6.0 11.5±5.4 8.0±0.6 366.2±96.7 CHB 18 179.2±36.7① 126.4±56.8① 70.6±30.4① 5.1±0.6① 267.2±125.7①肝衰竭 16 267.2±69.2①② 196.4±75.2①② 267.2±76.4①② 4.5±0.4① 246.3±184.1①健康人 20 37.4±4.6 37.1±7.3 16.3±3.6 - -

表2 四組外周血單個核細(xì)胞百分比及血清穿孔素和顆粒酶B水平（±s）比較

表2 四組外周血單個核細(xì)胞百分比及血清穿孔素和顆粒酶B水平（±s）比較

與 HBV 攜帶者比，①P＜0.05；與 CHB 組比，②P＜0.05

例數(shù) NK細(xì)胞 G2D+NK細(xì)胞 穿孔素（ng/L） 顆粒酶B（ng/L）HBV 攜帶者 20 5.1±1.5 3.4±1.1 15.2±3.2 23.0±3.5 CHB 18 8.5±2.0① 12.3±2.1① 31.5±3.6① 52.5±4.0①肝衰竭 16 8.8±1.6① 19.0±2.4①② 60.2±11.0①② 126.8±30.1①②健康人 20 14.2±2.1① 7.5±1.5① 13.9±4.0 21.1±3.9

2.3 四組肝組織NKG2D mRNA和蛋白表達(dá)情況比較 四組間肝組織NKG2D mRNA和NKG2D蛋白的比較均有差異（P＜0.05，表3）。

表3 四組肝組織NKG2D mRNA和蛋白表達(dá)（±s）比較

表3 四組肝組織NKG2D mRNA和蛋白表達(dá)（±s）比較

與 HBV 攜帶者比，①P＜0.05；與 CHB 組比，②P＜0.05

例數(shù) NKG2D mRNA NKG2D蛋白HBV攜帶者 20 0.1±0.0 0.0±0.0 CHB 18 3.5±0.9① 1.1±0.2①肝衰竭 16 7.0±1.2①② 1.8±0.2①②健康人 20 0.6±0.2① 0.3±0.0①

3 討論

CHB發(fā)病機(jī)制尚未明了，目前認(rèn)為可能與炎癥和免疫功能紊亂的變化有關(guān)。機(jī)體感染HBV后，自身免疫狀態(tài)是決定疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵[11，12]。NK細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞，與抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等生理過程有關(guān)，并且在某些病理條件下可參與自身免疫及超敏反應(yīng)，可以識別靶細(xì)胞和殺傷介質(zhì)[13，14]。一般認(rèn)為，NK細(xì)胞直接從骨髓中衍生，其發(fā)育和成熟依賴于骨髓的微環(huán)境。NK細(xì)胞的功能受到其表面受體的影響和調(diào)節(jié)。NK受體包括抑制性受體和激活性受體，抑制性受體主要是NKG2A，激活性受體包括 NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C和NKG2D。NKG2D的單獨活化即可刺激NK細(xì)胞活化，并且可以克服抑制性受體的強(qiáng)勢信號。NKG2D的表達(dá)是機(jī)體抗腫瘤和抗病毒感染的關(guān)鍵因素[15]。

近年來，NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒在肝損傷發(fā)病過程中的作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的重視[16-18]。NKG2D在正常人、慢性HBV攜帶者和乙型肝炎患者外周血和肝組織水平存在明顯差異。既往研究發(fā)現(xiàn)，NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒在激活NK細(xì)胞對k562細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的殺傷過程中起到重要作用[19]。NKG2D表達(dá)水平升高可激活NK細(xì)胞毒性作用，促進(jìn)肝衰竭的發(fā)生和發(fā)展。NKG2D表達(dá)水平降低可能使HBV逃避NK細(xì)胞的殺傷，致感染慢性化[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者和HBV相關(guān)慢加急（亞急性）肝衰竭患者外周血NK細(xì)胞頻率較慢性HBV攜帶者顯著升高，提示NK細(xì)胞參與了HBV感染患者的免疫耐受和抗HBV免疫。本研究并未發(fā)現(xiàn)肝衰竭和HBV攜帶者NK細(xì)胞頻率的差異，而在動物實驗研究中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝衰竭動物NK細(xì)胞水平較慢性乙型肝炎高[21]，研究結(jié)果的差異性可能與樣本量或物種有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同免疫狀態(tài)下的個體NKG2D+NK細(xì)胞頻率有明顯差異，免疫過強(qiáng)者其水平最高，在一定程度上反映NK細(xì)胞對HBV殺傷作用依賴于NKG2D。我們檢測了血清穿孔素和顆粒酶B水平，既往研究已證實NKG2D可以通過刺激靶細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B等殺傷介質(zhì)發(fā)揮效應(yīng)[22，23]。免疫過強(qiáng)患者NKG2D+NK細(xì)胞頻率較慢性乙型肝炎患者高，說明NKG2D過度活化對NK細(xì)胞毒性作用和肝組織病理學(xué)損傷的作用，甚至是肝衰竭發(fā)生的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，健康人外周血單個核細(xì)胞NKG2D+NK細(xì)胞頻率及肝組織NKG2D mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于病毒攜帶者，可能是因為慢性HBV攜帶者NK細(xì)胞活化性受體受到抑制，使得機(jī)體維持對HBV感染后的免疫耐受狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，免疫活動期慢性乙型肝炎患者外周血NK細(xì)胞水平較健康人群低，且NKG2D表達(dá)水平下降。NKG2D刺激分泌的γ干擾素水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)[23]。NKG2D對NK細(xì)胞活化的影響需要未來深入研究。對患者病情程度的評價缺乏量化指標(biāo)，例如肝纖維化程度和炎癥程度等。雖然NKG2D主要表達(dá)于NK細(xì)胞，但是G2D也可表達(dá)于CD8+T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞和某些病理條件下的CD4+T細(xì)胞，這些對本研究結(jié)果可能也有一定的影響。

綜上所述，NK細(xì)胞對肝損傷患者抗病毒應(yīng)答和免疫調(diào)控具有重要的意義。NKG2D可能通過NK細(xì)胞合成分泌穿孔素和顆粒酶B等殺傷介質(zhì)發(fā)揮效應(yīng)。不同免疫狀態(tài)下HBV感染患者NKG2D表達(dá)存在差異，下調(diào)NKG2D可能通過抑制NK細(xì)胞而改善免疫性肝損傷，甚至能預(yù)防肝衰竭的發(fā)生。