郝俊凱，周杰，劉兵1,

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100071；3.陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院，河北 張家口 075000

血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）起源于胚胎發(fā)育早期的中胚層前體-血液血管母細(xì)胞[1]。然而成熟血管內(nèi)皮體外擴(kuò)增困難，極大地限制了其功能研究及臨床應(yīng)用。2012年Salven 等發(fā)現(xiàn)成體血管內(nèi)皮中存在一群Kit+（也稱CD117）的血管內(nèi)皮干細(xì)胞（vascular endothelial stem cell，VESC），能在體外形成穩(wěn)定克隆并產(chǎn)生子代內(nèi)皮細(xì)胞，單克隆移植實驗也證實Lin-CD31+CD105+Sca1+Kit+表型的VESC 可以在體內(nèi)產(chǎn)生功能性血管[2]。2016年曾藝等在小鼠乳腺血管中也發(fā)現(xiàn)了CD201+（也稱Procr、EPCR）的VESC，具有分化為原代內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的雙向潛能[3]。這些研究提示了內(nèi)皮干細(xì)胞的存在及其分子特征。

造血細(xì)胞（hematopoietic cell，HC）的起源與血管內(nèi)皮密不可分。目前認(rèn)為胚胎早期造血細(xì)胞是由功能特化的生血內(nèi)皮（hematopoietic endothelium，HE）通過內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化（endothelial to hemato?poietic cell transition，EHT）分化而來[4]。小鼠胚胎期的造血細(xì)胞均表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31 和CD144（也稱VE-cadherin，血管內(nèi)皮鈣黏蛋白）[5]，也間接證實了造血細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞有著共同起源。研究胚胎早期內(nèi)皮和造血的發(fā)育過程，有助于揭示它們的起源、轉(zhuǎn)歸以及諸多調(diào)控因素的相互關(guān)系。

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）是早期胚胎（原腸胚期之前）或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，無論在體外或體內(nèi)環(huán)境，ESC 都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。與其他干細(xì)胞相比，ESC 具有更強(qiáng)的增殖能力、多能性及低免疫原性,是組織工程化研究的熱門對象。但是，如何控制ESC 定向誘導(dǎo)分化、提高誘導(dǎo)效率，以及如何評價誘導(dǎo)細(xì)胞的質(zhì)量和功能是研究的難點(diǎn)。Keller等發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的誘導(dǎo)下，小鼠ESC 能分化為具有典型內(nèi)皮特點(diǎn)的貼壁型細(xì)胞和具有造血潛能的非貼壁型細(xì)胞[6-8]。2000年 Nishikawa 等證實，來自 ESC的Flk1+細(xì)胞可以作為血管祖細(xì)胞（vascular progenitor cell，VPC）分化成內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞（周細(xì)胞和血管平滑?。?，并可以再現(xiàn)血管組織過程[9]。2017年James等發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇（resveratrol，RESV）作為Notch 信號通路激活劑，能促進(jìn)人多能干細(xì)胞（human plu?ripotent stem cell，hPSC）向動脈內(nèi)皮細(xì)胞分化[10]。2006年Kristian 等發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)HOXB4基因可以促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞分化[11]。這些發(fā)現(xiàn)為體外誘導(dǎo)擴(kuò)增可供使用的內(nèi)皮和造血細(xì)胞的研究奠定了理論基礎(chǔ)。然而，內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞的體外誘導(dǎo)體系仍然不成熟。

根據(jù)胚胎期內(nèi)皮、造血細(xì)胞的起源規(guī)律，本研究提出在無血清的StemPro 培養(yǎng)體系中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）、activin A（激活素A）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor basic，F(xiàn)GF-Basic）和VEGF誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞系R1/E 形成擬胚體（embryoid body，EB），模擬中胚層發(fā)育過程，再用SCF、VEGF和SCF、FLt3 配體（FLt-3 ligand，F(xiàn)Lt3）、白細(xì)胞介素3（interleukin-3，IL-3）分別定向誘導(dǎo)EB 分化為EC和HC，并同時驗證是否有內(nèi)皮干祖細(xì)胞（endothelial stem and progenitor cell，ESPC）和造血干祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）的存在，建立胚胎干細(xì)胞體外定向血管內(nèi)皮和造血細(xì)胞分化系統(tǒng)。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6 小鼠購自北京維通利華公司（動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2016-0011），通常選取d12～d14的孕鼠處死后取胚胎，用于制備小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（murine embryonic fibroblast，MEF）作為小鼠胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞。小鼠均在軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心無特異性病原菌（SPF 級）實驗動物房飼養(yǎng)［飼養(yǎng)設(shè)施合格證號:SYXK-（軍）2012-0021］。

小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E（ATCC SCRC-1036）、基質(zhì)細(xì)胞OP9-DL1（ATCC CRL-2749）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）由自己制備。

鼠源SCF、FLt3、IL-3、BMP4、激活素A、FGFBasic 和VEGF均購自Peprotech公司；CD31-PE（MEC13.3）、CD45-FITC（30-F11）、CD144-PE-Cy7（eBioBV13）、CD201-APC（eBio1560）、Flk1-APC（Avas12a1）、Kit- Biotin（2B8）、APC- eFluor780（eB149/10H5）、7-氨基放線菌素 D（7-amino-acti?nomycin D，7-AAD）均購自eBioscience 公司；純化的大鼠抗小鼠 CD31（MEC13.3）購自 BD 公司；α-MEM、IMDM 培養(yǎng)基均購自Gibco 公司；Ⅰ型膠原酶、牛血清白蛋白（BSA）、絲裂霉素C、二甲基亞砜（DMSO）、多聚甲醛（PFA）均購自Sigma 公司；山羊抗大鼠IgG 二抗、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱（Forma K3111）、細(xì)胞計數(shù)儀均購自Thermo Fisher 公司；臺式高速離心機(jī)（5804R）、移液器均購自Eppendorf 公司；低溫高速離心機(jī)（X-15R）購自Bechman 公司；顯微鏡（E200、DMIRB）分別購自Nikon 公司和Leica 公司；流式細(xì)胞儀（FACS Aria 2、Calibur）購自BD 公司；生物凈化工作臺購自北京亞太科隆儀器有限公司；解剖剪、解剖鑷均購自Horotec 公司；Petri dish、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板均購自Corning 公司，流式管、40 μm 細(xì)胞濾膜均購自Falcon公司。

1.2 液體配制

1.2.1 胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇傳代培養(yǎng)基（30 mL 體系）24.5 mL DMEM（含葡萄糖），1.5 mL胎牛血清（FBS），4.5 mL KnockOut 血清替代品（KnockOut serum replacement，KSR），30 μL 三抗，300 μL 非必需氨基酸，90 μL β巰基乙醇，300 μL L-谷氨酰胺（以上試劑均購自Gibco 公司）；30 μL 白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF，購自 Invitrogen 公司）。

1.2.2 無血清StemPro 培養(yǎng)液（10 mL 體系） 10 mL StemPro-34 SFM，100 μL 三抗，250 μL 營養(yǎng)添加劑（以上試劑均購自Gibco 公司）；1 μL BMP4，1 μL激活素A，0.5 μL FGF-basic，0.5 μL VEGF。

1.2.3 胰酶消化液 將Trypsin-EDTA（0.25%）與DMEM（含高糖）按1∶9 混合，用于將擬胚體消化成單細(xì)胞。

1.2.4 抗體稀釋液 含0.1%或1% BSA的PBS。

1.2.5 中和液 含2% FBS的PBS。

1.3 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備

處死d12.5～d14.5的孕鼠，75%酒精消毒約1 min。以下步驟須無菌操作。將胎盤和羊膜與胚胎分離，去除內(nèi)臟（所有深色部分）、胚胎頭部、四肢和血（血長得快會對MEF造成很大影響），軀干部分（去除四肢后）轉(zhuǎn)移至加有0.5 mL 胰酶（使用前須置于冰上）的1.5 mL EP 管內(nèi)，置于冰上；將組織剪碎約100 次（不能過于碎爛），補(bǔ)加0.5 mL 胰酶，37℃孵育10～15 min，每5 min 振蕩1 次（或37℃、600 r/min 振蕩）；將消化后的胚胎轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，加5 mL DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min 離心 3～5 min，去除上清，加15 mL DMEM 完全培養(yǎng)基吹散，轉(zhuǎn)移至25 cm 大培養(yǎng)皿，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日更換新鮮培養(yǎng)基，可根據(jù)MEF 生長情況用泵吸去貼壁的大團(tuán)組織；第3 d 用絲裂霉素C（10 μg/mL）處理MEF，消化分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)流程

1.4.1 胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇及懸浮誘導(dǎo)擬胚體 將小鼠胚胎干細(xì)胞R1/E 和MEF 用ESC 復(fù)蘇傳代培養(yǎng)基共復(fù)蘇于6 孔板中（1.7×105/孔），48 h 后換液；72 h 后用稀釋好的胰酶消化液消化，改用無血清的 StemPro 培養(yǎng)基于 Petri dish（5×104～8×104/dish）中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加BMP4、激活素A、FGF-Basic、VEGF（終濃度均為 5 ng/mL），第 3 d半量加液，第4 d 鏡下觀察擬胚體形狀及數(shù)量，流式檢測其表面標(biāo)志表達(dá)情況。

1.4.2 擬胚體定向誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞 取誘導(dǎo)4 d 后的EB 消化為單細(xì)胞，與OP9-DL1 共孵育于24 孔板中（3.8×104/孔），分別加入內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液（含SCF、VEGF，終濃度均為100 ng/mL）和造血細(xì)胞誘導(dǎo)液（含SCF、FLt3、IL-3，終濃度均為100 ng/mL）進(jìn)行貼壁誘導(dǎo)，誘導(dǎo)第3 d 半量加液，第6 d 鏡下觀察誘導(dǎo)情況，尋找典型內(nèi)皮簇、造血集落，流式檢測EC、HPC 特征性表面標(biāo)志表達(dá)情況，進(jìn)而驗證ESPC和HSPC 群體的存在（圖1）。

圖1 胚胎干細(xì)胞體外定向內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞分化策略圖

1.5 流式細(xì)胞儀分析內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞

1.5.1 擬胚體細(xì)胞標(biāo)記抗體 用膠原酶將擬胚體消化成單細(xì)胞懸液，用含 2% FBS的 PBS 洗滌 1～2 次，310 r/min 離心6 min，用100 μL 含0.1% BSA的PBS重懸，按照抗體說明書用量加入抗體PE-cy7 anti-CD31（1.5 μL）、APC anti-Flk1（2.5 μL）、PE anti-CD201（0.31 μL），4℃避光反應(yīng)30 min，中和，用含2% FBS的 PBS 洗滌 1～2 次，用 500 μL 含 0.1% BSA的PBS 重懸，無菌細(xì)胞濾膜濾過，導(dǎo)入流式管，用AriaⅡ流式儀分析。

1.5.2 誘導(dǎo)后的內(nèi)皮細(xì)胞、造血祖細(xì)胞標(biāo)記抗體將誘導(dǎo)至第6 d的EC 和HPC 消化成單細(xì)胞懸液，用含2% FBS的 PBS 洗滌 1～2 次，310 r/min 離心 6 min，用100 μL含0.1% BSA的PBS重懸，先加Biotin anti-Kit（0.5 μL），4℃避光反應(yīng)30 min，再按抗體說明書用量加入抗體PE anti-CD31（1.5 μL）、FITC anti-CD45（1 μL）、APC-eflour780 anti-Biotin（0.625 μL）、APC anti-CD201（1.25 μL）、PE-cy7 anti-CD144（0.625 μL），4℃避光反應(yīng)30 min，中和，用含2%FBS的 PBS 洗滌 1～2 次，用 500 μL 含 0.1% BSA的PBS 重懸，無菌細(xì)胞濾膜濾過，導(dǎo)入流式管，用AriaⅡ流式儀分析。

1.6 免疫組化顯色觀察內(nèi)皮誘導(dǎo)情況

取誘導(dǎo)至第6 d的24 孔板，用含2% PFA的PBS室溫固定20 min，PBS 洗滌2 次，每次3 min；每孔加入anti-CD31 大鼠抗小鼠一抗（綠色）500 μL，4℃搖床過夜，次日取出，回收一抗，PBS 洗滌2 次，每次3 min；每孔加入400～500 μL 山羊抗大鼠的二抗（橙色），室溫?fù)u床30 min，回收二抗，PBS 洗滌2 次，每次3 min；每孔加入400 μL DAB 顯色液，邊顯色邊鏡下觀察內(nèi)皮簇，感覺背景顏色較深時吸走DAB，每孔加400 μL PBS 終止顯色，棄去后再換1 次新的PBS，用保鮮膜包裹孔板，以備日后拍照查看。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

流式數(shù)據(jù)用Flowjo 10.0.7 軟件分析；做圖采用GraphPad Prism 5 軟件；統(tǒng)計分析采用SPSS 12.0 軟件。

2 結(jié)果

2.1 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的擬胚體含有中胚層表型、內(nèi)皮表型及干祖細(xì)胞表型

將胚胎干細(xì)胞R1/E 復(fù)蘇于6 孔板內(nèi)2 d 后，轉(zhuǎn)至 Petri dish 中懸浮誘導(dǎo) ESC 向 EB 分化，模擬中胚層發(fā)育過程，加入無血清的StemPro 培養(yǎng)基，前2 d 不換液，擬胚體以肉眼可見的速度迅速增長。顯微鏡下觀察可見細(xì)胞間黏附緊密，克隆邊界清楚，胚體飽滿（圖2A）。流式分析其表面標(biāo)志表達(dá)情況，1.14%的細(xì)胞表型為Flk1+，提示這部分細(xì)胞已具有中胚層特性（圖2B）；24.4%的細(xì)胞表型為CD31+，提示這部分細(xì)胞已帶有內(nèi)皮標(biāo)記特性（圖2C）；同時發(fā)現(xiàn)約1.04%的細(xì)胞表型為CD201+（圖2D）。

圖2 體外誘導(dǎo)4d后擬胚體的形態(tài)和表面標(biāo)記的表達(dá)

圖3 OP9-DL1共培養(yǎng)6d后24孔板內(nèi)皮細(xì)胞定向分化結(jié)果

2.2 內(nèi)皮定向誘導(dǎo)分化結(jié)果

擬胚體向內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)6 d 后，流式分析其表面標(biāo)志表達(dá)情況。在55.8%的CD45-細(xì)胞群體中，約1%的細(xì)胞表型為CD31+CD144+，提示這群細(xì)胞具有典型的內(nèi)皮表型（圖3A）。CD31 免疫組化染色后，在顯微鏡下可觀察到多個被DAB染成棕色的典型單層扁平狀的內(nèi)皮細(xì)胞（圖3B 紅箭頭所示），顯示被anti-CD31 抗體標(biāo)記上，細(xì)胞呈短梭型，形態(tài)飽滿，聚集成管狀結(jié)構(gòu)，立體感增強(qiáng)。分析CD31+CD144+CD45-的內(nèi)皮細(xì)胞群體，3.15%的細(xì)胞表型為Kit+CD201+，提示可能是處于內(nèi)皮細(xì)胞分化上游、具有干祖細(xì)胞表型特性的ESPC 群體（圖3C）。

2.3 造血定向誘導(dǎo)分化結(jié)果

擬胚體向造血細(xì)胞定向誘導(dǎo)6 d 后，流式分析其表面標(biāo)志表達(dá)情況（圖4）。34.7%的細(xì)胞表型為CD45+，誘導(dǎo)效率較內(nèi)皮細(xì)胞有較大提升。在這群CD45+造血細(xì)胞中，有0.34%的細(xì)胞表達(dá)Kit+CD201+，表型接近于CD201+的Ⅱ型造血干細(xì)胞前體（pre-hematopoietic stem cell，pre-HSC，表型為CD31+CD45+Kit+CD201high），提示這群細(xì)胞可能是具有定向造血潛能的HSPC。綜合內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的結(jié)果，本研究建立的ESC 體外誘導(dǎo)體系可行，在誘導(dǎo)后的內(nèi)皮、造血細(xì)胞里均發(fā)現(xiàn)了不同比例的Kit+CD201+干祖細(xì)胞分子特征的群體，提示內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞在發(fā)育上游可能存在各自的前體細(xì)胞，并且可能有共同的中胚層祖細(xì)胞起源。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分類圖

3 討論

胚胎干細(xì)胞是具有發(fā)育全能性的高度未分化細(xì)胞，想直接誘導(dǎo)獲得特定細(xì)胞類型的研究策略通常會產(chǎn)生混合細(xì)胞群，如何通過誘導(dǎo)控制向內(nèi)皮、造血細(xì)胞定向分化，提升誘導(dǎo)效率是研究中的難點(diǎn)。Luttun 等嘗試將內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)劑直接加入ESC 培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)效率卻無明顯提升，可能的原因是沒有遵循內(nèi)皮細(xì)胞在胚胎中正常的分化演變模式[12]。產(chǎn)生成血管細(xì)胞和造血細(xì)胞的血液血管母細(xì)胞起源于中胚層[1]，而Chad 等發(fā)現(xiàn) GSK3β抑制劑 CHIR99021 可以激活經(jīng)典的 Wnt/β-catenin 信號通路，與 BMP4 二者結(jié)合能更好地將干細(xì)胞向中胚層誘導(dǎo)[13]。本研究抓住內(nèi)皮、造血細(xì)胞在分化發(fā)育層級上共同來源于中胚層這一屬性，先將胚胎干細(xì)胞懸浮誘導(dǎo)為擬胚體，加入 BMP4、激活素 A 激活 TGF-β 信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞標(biāo)記中胚層特性。Zhou 等發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）單獨(dú)不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞CD31和CD144的表達(dá)，但是在VEGF和BMP4的協(xié)同作用下，卻可以增強(qiáng)其表達(dá)，誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞（hPSC）向VPC 分化[14]。因此本研究誘導(dǎo)體系中還加入了FGF 和VEGF 促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、遷移，成功地誘導(dǎo)出EC、HC 以及各自的Kit+CD201+干祖細(xì)胞表型群體，提示內(nèi)皮和造血細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中可能來源于共同的中胚層祖細(xì)胞。不僅如此，使用完全無血清的培養(yǎng)基StemPro 培養(yǎng)ESC，在促進(jìn)其誘導(dǎo)分化的同時，也可以評估培養(yǎng)基中單一組分的細(xì)胞因子對誘導(dǎo)效率的影響，變異性低。而本研究團(tuán)隊在2016年利用創(chuàng)新的單細(xì)胞孵育移植技術(shù)，結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的CD201 分子的特異性高表達(dá)，實現(xiàn)了pre-HSC 高達(dá)30%的純度富集[15]，也提示可以利用先進(jìn)的單細(xì)胞測序平臺深度挖掘EC、HC 群體的其他特征分子，繼而更好地優(yōu)化體外誘導(dǎo)分化策略。

血管生長和重塑是一個貫穿于生命全程持續(xù)發(fā)生的生理事件，它伴隨著所有組織器官的發(fā)育和自穩(wěn)態(tài)維持，一旦發(fā)生動態(tài)失衡，就可能引起組織病變，甚至導(dǎo)致疾病發(fā)生。眾多研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞中的確存在一群有分化潛能的前體細(xì)胞，表型為Kit+或CD201+，通過其有限的自我更新和分化潛能，維持著血管系統(tǒng)的穩(wěn)定[2-3]，本研究也證實了這一點(diǎn)。在誘導(dǎo)出的內(nèi)皮細(xì)胞中，存在一群CD31+CD144+CD45-Kit+CD201+細(xì)胞，表型與文獻(xiàn)報道的內(nèi)皮干細(xì)胞吻合，提示處于分化發(fā)育上游，數(shù)量非常有限。目前的體外實驗證據(jù)證明，內(nèi)皮干祖細(xì)胞在客觀上是存在的，它們通過維持較高的干祖細(xì)胞特性和有限的數(shù)量來保持分化發(fā)育潛能。在今后的研究中或許能夠發(fā)現(xiàn)更為特征性的表面標(biāo)記，比我們目前認(rèn)識的分子更能有效地識別和富集ESPC，使內(nèi)皮干細(xì)胞的定義更加明確，也為大規(guī)模組織工程化研究提供更堅實的理論依據(jù)。

造血細(xì)胞起源一直是發(fā)育領(lǐng)域研究的核心問題之一。盡管已有大量證據(jù)證實造血細(xì)胞來源于生血內(nèi)皮[16-18]，但內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化過程中的諸多細(xì)節(jié)仍然未知，并不能排除發(fā)育過程中的其他潛在途徑。本研究表明，在細(xì)胞因子SCF、FLt3、IL-3的誘導(dǎo)下，與OP9-DL1 基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)6 d這種誘導(dǎo)pre-HSC 轉(zhuǎn)化為成熟HSC的實驗方法，也能誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生具有造血干祖細(xì)胞樣的細(xì)胞。這群細(xì)胞的表型為CD45+Kit+CD201+，比例約占總細(xì)胞群體的0.1%，與之前文獻(xiàn)報道的Ⅱ型pre-HSC（CD31+CD45+Kit+CD201high）表型相似[15]，體外誘導(dǎo)實驗的結(jié)果能否與已知胚胎造血發(fā)育時間節(jié)點(diǎn)和位點(diǎn)存在對應(yīng)關(guān)系，也為今后的研究提供了思路。