倪艷麗，李昀橋 ，蘭雨，劉兵

1.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院，北京 100071；2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學中心，北京 100071；3.暨南大學 基礎醫(yī)學院，廣東 廣州 510632

造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新和多向分化的潛能，持續(xù)不斷產生機體所需的各類血細胞。小鼠胚胎發(fā)育早期，第一波原始造血起源于胚胎期第7.25 d（E7.25）卵黃囊區(qū)域的造血祖細胞，其快速產生有核原始紅細胞、巨核細胞和巨噬細胞等多種功能細胞。緊隨其后，E8.25的卵黃囊血管產生了第二波短暫的永久造血祖細胞——紅髓系祖細胞（erythro-my?eloid progenitor，EMP）。EMP 可遷移至小鼠胎肝，并具有分化為成熟紅細胞、巨核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞的能力。卵黃囊產生的原始造血細胞對于小鼠胚胎期的生存不可或缺，并極大地貢獻了成體時期不同組織中的駐留型免疫細胞[1]。直至E10.5，第三波最為重要的定向造血以產生第一個具有長期重建成體造血系統(tǒng)潛能的HSC 為標志。HSC 可起源于胚胎體多個血管部位，包括主動脈-性腺-中腎（aorta-gonadmesonephros，AGM）區(qū)、頭部、胎盤和卵黃囊[2-3]。研究顯示，AGM 區(qū)是HSC 生成的最主要位點，其產生的HSC 遷移至胎肝擴增，并于新生后歸巢骨髓，貢獻著機體終生造血活動。

造血干祖細胞的起源一直是造血發(fā)育研究的熱點。利用小鼠內皮示蹤研究策略，發(fā)現EMP群體起源于卵黃囊血管中的少部分內皮細胞，同時HSC 也起源于主動脈血管中的少量內皮細胞，提示內皮細胞是造血祖細胞的前體[4-5]。2010年，Traver 和Robin 研究團隊分別通過實時成像技術更直觀地發(fā)現AGM 區(qū)主動脈腹側的一群特化的血管內皮細胞以出芽的形式形成含有造血干祖細胞的造血簇，因此該過程被稱為內皮-造血轉化（endothelial to haematopoietic transition，EHT），這部分特化的內皮細胞被定義為生血內皮細胞（hemogenic endothelial cell，HEC）[6-7]。直至最近，de Bruijn 和Dzierzak 團隊分別利用Runx1+23GFP和Ly6a-GFP 小鼠模型標記并分離生血HEC，并初步嘗試揭示其分化規(guī)律及分子特征[8-9]。然而迄今仍無有效的表面分子進行HEC的有效富集，使得相關研究停滯不前。

我們研究團隊采用單細胞孵育誘導移植策略結合細胞表面標志CD201的特異性高表達，首次實現了EHT 過程中關鍵細胞群體——HSC 前體的高效捕獲，并在單細胞水平揭示了其分子表達規(guī)律，為精準富集和研究生血內皮群體提供了重要的范式[10]。在此基礎上，本研究擬采用流式Index Sorting 新技術鑒定小鼠胚胎HEC的表面標志分子表達特征，并結合體外孵育實驗及免疫組化染色技術驗證HEC的造血分化潛能。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL 純品系小鼠購自斯貝福生物有限公司，動物質量合格證號SCXK（京）2016-0002，飼養(yǎng)在軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心，飼養(yǎng)條件為無特異性病原菌環(huán)境（specific pathogen free，SPF），實驗動物飼養(yǎng)設施合格證號為SYXK（軍)2012-0021。

小鼠 FACS 抗體 CD31（MEC13.3）、CD43（S7）均購自 BD Biosciences 公司；CD41（MWReg30）、CD45（30-F11）、Kit（2B8）和 CD47（miap301）均購自eBioscience 公司；7-氨基放線菌素D（7-amino-actinomycin D，7-AAD）購自Invitrogen 公司；重組人血管內皮生長因子（rhVEGF-165）、小鼠干細胞生長因子（SCF）均購自Peprotech 公司；L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、IMDM 培養(yǎng)基均購自Hyclone 公司；Ⅰ型膠原酶、牛血清白蛋（BSA）、轉鐵蛋白均購自Sigma 公司；巰基乙醇購自Gibco 公司；胰島素購自Macgene 公司；臺式高速離心機（Eppendorf 5804R）購自Eppendorf 公司；細胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma K3111）購自 Thermo 公司；解剖鏡（Leica S8APOLZ）購自萊卡公司；48 孔培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿（Costar）、流式細胞儀購自BD 公司。

1.2 小鼠AGM區(qū)組織解剖

雄鼠與雌鼠合籠后，次日中午雌鼠陰道口檢出精栓記為E0.5，d10（體節(jié)數為30～34 個）時解剖取出小鼠胚胎，在解剖鏡下分離胚胎組織；孕鼠取出孕囊后，從兩側子宮角用鑷子撕開,剝離胎盤，獲得由卵黃囊包裹的胚胎；截去臍血管與卵黃血管后，從胚胎體的上下肢芽間截斷背脊側，去除原腸后獲得含有胚胎AGM 區(qū)的組織，隨后輕輕鈍性分離AGM 區(qū)。

1.3 單細胞懸液制備

1.3.1 AGM 組織消化 0.1%的Ⅰ型膠原酶于37℃消化25 min，用含10%血清的IMDM 培養(yǎng)基中和，4℃、310 r/min 離心6 min，棄上清后重懸獲得單細胞懸液。

1.3.2 流式分析和分選 將單細胞化后的細胞用含2%血清的PBS 清洗1 次，按照抗體說明書推薦量添加抗體，4℃混懸孵育抗體30 min。用含2%血清的PBS 洗1 次，標記7-AAD，室溫孵育5 min，加入一定體積的含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 稀釋細胞溶液后，流式細胞儀分析或分選。

1.4 OP9-DL1基質細胞共孵育

OP9-DL1 細胞提前 24 h 鋪到 48 孔板，分選之前更換加入含15%胎牛血清（FBS）、1% BSA、10 mg/mL 胰島素、200 mg/mL 轉鐵蛋白、10-4mol/L 巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、100 ng/mL rhVEGF-165 和50 ng/mL SCF的IMEM 溶液，流式細胞儀分選單個目的細胞至鋪好OP9-DL1 細胞的48 孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱于37℃孵育7 d，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.5 免疫組化染色

單細胞與OP9-DL1 細胞孵育7 d 后棄上清，用適量2%多聚甲醛溶液室溫固定細胞15～20 min。①內皮細胞染色：固定后PBS 清洗1 次，孵育CD31 一抗4℃過夜，次日回收一抗，孵育辣根過氧化物酶二抗標記30 min，之后用DAB 顯色（藍色）；②造血細胞染色：內皮染色后PBS 清洗3次，孵育CD45 一抗4℃過夜，次日回收一抗，孵育辣根過氧化物酶二抗標記30 min，之后用DAB 顯色（棕色）。顯微鏡下分別統(tǒng)計具有造血和內皮潛能的孔數，采集照片。

1.6 統(tǒng)計學分析

流式細胞分析數據使用Flowjo7.6.1 軟件處理，統(tǒng)計學數據采用Graphpad 軟件處理。

2 結果

2.1 單細胞Index Sorting原理及使用

流式細胞Index Sorting 技術是一種全新的單細胞分選模式，在分離單細胞的同時，可以讀取并存儲每個細胞的所有蛋白熒光表達值和細胞散射參數特征。結合單細胞的功能實驗數據或單細胞組學數據，借助強大的計算機存儲和分析能力，可追溯分析每個目的細胞所獨有的特征參數[11]。該技術的優(yōu)勢在于：①同時記錄高達數十種細胞特征參數，在數百萬細胞中可精準定位單個目的細胞，重復性好；②對于探索免疫表型未知的細胞群體具有極強的應用價值。

與以往單細胞分選技術相比，Index Sorting 技術較為完美地將單細胞流式分選、單細胞功能驗證和單細胞組學有效結合在一起，使之成為一整套研究方案。目前單細胞Index sorting 技術較多應用于造血和免疫系統(tǒng)研究，而在其他研究領域應用才剛剛開始[12]。

本研究中，我們首先對BD ArialⅡ流式細胞儀進行軟硬件升級改造，使之符合6～384 孔板分選操作的需求。BD ArialⅡ加裝單細胞分選硬件模塊的同時，升級操作至DIVA8 版本，同時擴展相應的計算機存儲空間和內存以保證流式軟件流暢運行。結果如圖1顯示，以48 孔板分選為例，操作界面右下方紅框內為Index Sorting 選項，界面下方為分選目的細胞群體門及單細胞分選方式，界面上方顯示并記錄48 孔中每個細胞的流式特征參數。后續(xù)通過每個孔的單細胞體外實驗數據結果，可追溯目的細胞所在流式群體門的位置，并直觀標記在流式結果圖上。

2.2 Kit+內皮細胞具有生血潛能

采用建立的單細胞Index Sorting 新技術，我們計劃更精細地分析小鼠E10 AGM 區(qū)的HEC 群體。已有研究表明HEC 表達經典的內皮細胞表面分子CD31 和CD144（VE-cadherin），不表達公認的造血表面分子CD45、CD41 和CD43 等。Kit（CD117）作為成體小鼠骨髓造血干祖細胞表面標志，也可用于富集小鼠E11 AGM 區(qū)pre-HSC。提示應用 Kit 富集 HEC的可行性[13]。

流式分析表明CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+在小鼠E10 AGM 細胞中的比率約為3%（圖2A、B）。流式分選單個CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+細胞，與基質細胞OP9-DL1 共孵育誘導培養(yǎng)7 d 后進行免疫組化染色，約12%（49/416）的細胞生成CD31+內皮管狀結構，約31%（129/416）的細胞可產生CD45+造血細胞簇，提示具有生血潛能（圖2C、D）。這部分研究結果同時表明，60%以上的Kit+細胞不具備生血或生內皮功能（圖2E），提示仍須進一步探索富集HEC 表面分子。

2.3 表面分子CD47顯著富集生血內皮細胞

我們前期研究發(fā)現表面分子CD47 部分表達在AGM 區(qū)血管內皮細胞及pre-HSC 上，分別通過富集CD47-和CD47+的內皮和pre-HSC，經體外誘導孵育結合小鼠移植實驗發(fā)現，具有HSC 活性的細胞均富集在CD47+細胞群體中，提示CD47 可進一步用于標記發(fā)育階段更早的HSC 相關群體。例如，在單細胞水平，它是否能識別具有生血潛能的HEC，而近期的研究表明AGM 區(qū)的造血祖細胞和HSC 均來源于HEC。

為了證實這一結論，應用流式細胞Index Sorting 技術的可回溯性功能，即在上述分選群體標志的基礎上同時標記CD47 分子，后續(xù)根據體外孵育培養(yǎng)的結果，可以追溯我們關注的重要細胞群體的CD47 分子的表達情況。分析發(fā)現，CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+的內皮細胞群體中，約60%的細胞表達CD47。此外，具有生內皮、生血潛能的CD41-CD43-CD45-CD31+Kit+細胞均富集在CD47+的細胞群體（圖3A、B）。該結果提示CD47表達可將HEC 群體的精度顯著提高1.5 倍（圖3B）。

圖1 48孔板單細胞Index Sorting分選操作界面

根據體外孵育誘導培養(yǎng)結果，我們進一步發(fā)現CD47 陽性的內皮群體中仍有60%以上不具備生內皮或生血能力，表明未來須通過我們已建立的流式細胞Index Sorting 技術繼續(xù)發(fā)掘HEC的新表面標志分子，以進一步提高富集HEC的精度。

3 討論

生血內皮群體是內皮向造血轉化過程中極為重要的關鍵群體，因其數量極其稀少、命運轉化時間窗口短暫、分子表型特征不明等因素，使得目前仍無有效手段去精準定位及富集該類細胞?，F有研究提示，胚胎時期AGM 區(qū)主動脈血管內皮通過形成造血簇的方式產生造血干細胞的過程中還存在2 類造血干細胞前體。我們前期利用創(chuàng)新的單細胞孵育移植技術結合CD201 分子的特異性高表達，實現了造血干細胞前體高達30%的精度富集，本研究則進一步提供了全新的干細胞發(fā)育研究思維和范式。單細胞技術應用和開發(fā)中方法學的創(chuàng)新，將極大地推動造血干細胞發(fā)育研究領域的進展。因此，本研究建立了單細胞Index Sorting 技術，并探索尋找發(fā)育時間更早、表型更不明確的生血內皮群體。

同時，前期積累的大量造血干細胞發(fā)育全程的單細胞轉錄組測序數據，也為進一步發(fā)掘并富集出生血內皮群體提供了重要線索，如本研究發(fā)現Kit、CD47、CD201 等均能有效富集出具有生血潛能的內皮。這些研究基礎將為后續(xù)進一步探索生血內皮提供重要的數據支持。綜上，我們建立了單細胞Index Sorting 技術，并應用該技術發(fā)現具有造血潛能的生血內皮均富集在CD47+的內皮細胞群體中，CD47 分子將生血內皮群體的精度顯著富集了1.5 倍以上。

圖2 OP9-DL1共培養(yǎng)后48孔板中單個CD41-CD43-CD45-CD31+KIT+細胞的分化潛能

圖3 Index Sorting分析CD47富集HEC