佟雪紅 ，湯新慧，鮑成滿，楊小蘭，陳　倩，陶　萍

(1.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 鹽城 224051;2.鹽城師范學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

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大菱鲆胚胎生長與核酸關(guān)系的研究

佟雪紅1，2，湯新慧2，鮑成滿2，楊小蘭2，陳倩2，陶萍2

(1.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 鹽城 224051;2.鹽城師范學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

對大菱鲆胚胎發(fā)育過程進(jìn)行觀察，研究胚體的生長性能以及核酸、蛋白的變化，分析生長性狀與生化指標(biāo)間的關(guān)系。結(jié)果表明：(1) 在不同發(fā)育時期，大菱鲆胚體長度呈現(xiàn)“縮小—膨大—再縮小—再膨大”的變化過程，在受精后5 h 40 min出現(xiàn)最小值0.998 mm，在孵化期出現(xiàn)最大值1.089 mm。(2) 油球在卵裂期之前逐漸增大，在卵裂期之后逐漸縮短；在受精后9 h 40 min的多細(xì)胞期達(dá)到最高值0.192 mm，在受精后65 h達(dá)到最低值0.176 mm。(3) 胚體質(zhì)量在原腸期之前呈增大趨勢，原腸期之后呈降低趨勢；在受精后7 h 30 min的128細(xì)胞期出現(xiàn)最低值0.340 mg，在9 h 40 min的多細(xì)胞期出現(xiàn)最高值0.674 mg。(4) RNA/DNA和蛋白質(zhì)/DNA比率變化表明，大菱鲆胚胎發(fā)育至卵裂期后，胚體的生長以細(xì)胞增殖為主直至囊胚期；之后胚體生長以細(xì)胞增大為主直至原腸期；胚胎發(fā)育至原腸期后，胚體的生長以細(xì)胞增殖為主直至器官形成期；之后胚體生長以細(xì)胞增大為主直至孵出；即大菱鲆胚體的生長是細(xì)胞增殖和細(xì)胞增大周期性交替的過程。(5) 胚胎形態(tài)性狀和胚體質(zhì)量跟生化指標(biāo)間均為“二項式”關(guān)系，而且RNA/DNA比率是與胚胎生長性狀關(guān)系密切的指標(biāo)。

大菱鲆；胚胎發(fā)育；核酸；RNA/DNA

大菱鲆屬于鰈形目鲆科，在中國又稱“多寶魚”，身體扁平近似圓型，雙眼位于左側(cè)。大菱鲆生長迅速，具有經(jīng)濟(jì)價值高、餌料轉(zhuǎn)換率高、抗病力強(qiáng)、耗氧量低等優(yōu)點，適合高密度養(yǎng)殖[1]。據(jù)統(tǒng)計，在2009年，大菱鲆產(chǎn)量占到鲆鰈魚類總產(chǎn)量的55%，是我國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種[2]。

魚類的生長性能是評價其品質(zhì)的重要指標(biāo)，關(guān)于外界因素對大菱鲆生長發(fā)育影響的研究已有一些報道，雷霽霖等[3]詳細(xì)描述了大菱鲆胚胎和仔稚魚的發(fā)育；苗淑彥等[4]分析了添加不同種類的碳水化合物對大菱鲆幼魚生長、成活以及魚體生理生化指標(biāo)的影響；阿榮等[5]研究了周期性饑餓再投喂對大菱鲆幼魚生長和能量收支的影響，等等。但是，關(guān)于大菱鲆胚胎期生長發(fā)育的研究較少，而胚胎長度、油球直徑、胚體質(zhì)量的變化是胚體生長的具體表征，因此，通過測定上述指標(biāo)可以明確胚體在不同發(fā)育期的生長狀況，對優(yōu)化飼育管理以及其他相關(guān)工作的開展均有重要的指導(dǎo)意義。

此外，有資料顯示，魚體的生化指標(biāo)，如核酸含量、總蛋白含量、RNA/DNA比率等，能精確反映出其生長的細(xì)微變化[6-9]，在傳統(tǒng)方法尚不能度量出魚類生長的變化時，生化指標(biāo)就能夠反映出魚類生長的細(xì)微變化和食物分布的波動，通過確立這些生化指標(biāo)跟生長的數(shù)量關(guān)系，能夠進(jìn)一步借助于上述生化指標(biāo)評價仔稚魚的生理狀況，這對于改善養(yǎng)殖管理條件有重要的應(yīng)用價值。近年來，以核酸和總蛋白為基礎(chǔ)的生化指標(biāo)已廣泛用于評估魚類胚后發(fā)育階段仔稚魚的生長，比如歐鰈[9]、牙鲆[10]、鯽魚[11]、鱸魚[12]、黑線鱈[13]、羅非魚[14]等。筆者對大菱鲆仔稚魚生長與生化指標(biāo)的聯(lián)系也進(jìn)行了詳細(xì)探討[15]，但上述工作都是圍繞胚后階段仔稚魚和幼魚的發(fā)育開展的，而大菱鲆胚胎期生長狀況及其與生化指標(biāo)關(guān)系的研究尚未見報道。為此，我們以大菱鲆胚胎為研究對象，通過測定胚體長度、胚體質(zhì)量、油球直徑、核酸和蛋白含量來研究胚體的生長特性，闡明胚胎生長指標(biāo)與生化指標(biāo)間的數(shù)量關(guān)系，以期為完善大菱鲆的人工育苗技術(shù)提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

大菱鲆胚胎發(fā)育實驗于2014年4月在山東萊州大菱鲆育苗場進(jìn)行。實驗用雌、雄親魚均取自親魚馴養(yǎng)池，將親魚人工催產(chǎn)后進(jìn)行受精，將品質(zhì)較好的浮性卵移入孵化網(wǎng)箱進(jìn)行孵化培育。

1.2方法

1.2.1胚胎發(fā)育的觀察

胚胎孵化過程中水溫為(14.4±0.5)℃，鹽度為31‰～33‰，pH 為7.9～8.3。用奧林巴斯顯微鏡(BX41)觀察胚胎的發(fā)育過程并確定發(fā)育期。

1.2.2樣品采集

在胚胎的不同發(fā)育期連續(xù)采樣，首先，每個發(fā)育期隨機(jī)取樣80粒，用于測定胚胎的長度、油球的直徑以及胚體質(zhì)量；其次，每個發(fā)育期隨機(jī)取樣100 mg，速凍于液氮中，用于測定胚體核酸和蛋白含量。

1.2.3測定方法

形態(tài)性狀和胚體質(zhì)量的測定：40粒樣品用于胚體長度和油球直徑的測定，采用與顯微鏡配套的電子目鏡進(jìn)行測量；另外40粒在吸干水分后測定其質(zhì)量，用電子天平進(jìn)行測量。

核酸和蛋白含量的測定：實驗樣品核酸物質(zhì)的測定采用Tong等[15]的方法進(jìn)行，在此基礎(chǔ)上略做修改，勻漿時的質(zhì)量體積比調(diào)整為1∶8。蛋白含量的測定依據(jù)Bradford[16]的方法進(jìn)行。

1.3數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得出平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，將實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，并建立胚體形態(tài)性狀、胚體質(zhì)量和生化指標(biāo)不同時期的變化趨勢圖。采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行方差分析，對胚體不同時期的形態(tài)性狀、胚體質(zhì)量、生化指標(biāo)分別進(jìn)行多重比較；同時，對胚體的形態(tài)性狀、胚體質(zhì)量與生化指標(biāo)進(jìn)行多元回歸分析，建立回歸方程。

2　結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)育期大菱鲆胚體長度

大菱鲆胚胎生長過程中，其長度整體呈增大趨勢。但在不同的發(fā)育期，胚體大小變化明顯，呈現(xiàn)出“縮小—膨大—再縮小—再膨大”的狀態(tài)。如圖1所示，實驗過程中，胚胎長度最小值為0.998 mm，出現(xiàn)在受精后5 h 40 min；最大值為1.089 mm，出現(xiàn)在受精后103 h，即孵化出膜時。根據(jù)不同發(fā)育時期胚體長度的平均值得出，受精卵到卵裂期呈縮小趨勢并在卵裂期達(dá)到最低值1.015 mm；之后保持增大狀態(tài)直至囊胚期(1.057 mm)；從囊胚期至原腸期，胚體再次出現(xiàn)縮小狀態(tài)，并在原腸期時達(dá)到1.045 mm；之后胚體保持膨大狀態(tài)直至孵化(1.089 mm)。

2.2不同發(fā)育期胚體油球直徑

不同發(fā)育時期，大菱鲆胚體中油球直徑變化如圖2所示。從受精卵到卵裂期，油球整體保持增長趨勢，并且在受精后9 h 40 min的多細(xì)胞期，油球直徑呈現(xiàn)最高值0.192 mm；在受精后17 h 10 min的原腸早期，油球直徑降為0.181 mm；之后，油球呈波動性增長并在47 h 50 min的器官形成早期達(dá)到0.189 mm；在受精后65 h，油球直徑達(dá)到最低值0.176 mm；此后，油球緩慢增長并在受精后86 h的心跳出現(xiàn)期達(dá)到0.186 mm；在103 h的孵化期，油球直徑降為0.180 mm。根據(jù)不同發(fā)育時期油球直徑的平均值得出，油球直徑從受精卵至卵裂期逐漸增大并在卵裂期達(dá)到最高點0.186 mm；之后逐漸縮短，在囊胚期、原腸期、器官形成期、孵化期分別達(dá)到0.185，0.184，0.183，0.180 mm。隨著生長發(fā)育進(jìn)行，油球長度逐漸減少，說明胚體對油球中脂類和脂肪酸的利用比率逐漸增加。

橫軸中數(shù)字代表發(fā)育期，各個發(fā)育期對應(yīng)的受精后時間分別為：0為剛受精的受精卵；1為3 h 10 min；2為3 h 40 min；3為4 h 40 min；4為5 h 40 min；5為6 h 50 min；6為7 h 30 min；7為9 h 40 min；8為10 h 40 min；9為11 h 50 min；10為17 h 10 min；11為24 h；12為29 h 30 min；13為36 h；14為39 h 10 min；15為47 h 50 min；16為56 h 50 min；17為65 h；18為72 h 30 min；19為79 h 35 min；20為86 h；21為103 h。其中：0為受精卵，1～7為卵裂期，8～9為囊胚期，10～14為原腸期，15～20為器官形成期，21為孵化期。圖中無相同字母數(shù)據(jù)間表示差異顯著(P<0.05)。下同。圖1　不同發(fā)育期大菱鲆胚體長度Fig.1　Embryonic length of turbot during different developmental stages

圖2　不同發(fā)育期胚體油球直徑Fig.2　Oil globule diameter of embryo during different developmental stages

2.3不同發(fā)育期胚體質(zhì)量

不同發(fā)育期，大菱鲆胚體質(zhì)量如圖3所示。胚體質(zhì)量從受精卵到卵裂期變化比較劇烈，在受精后4 h 40 min出現(xiàn)第一個高峰值0.627 mg，在7 h 30 min的128細(xì)胞期出現(xiàn)最低值0.340 mg，在9 h 40 min的多細(xì)胞期出現(xiàn)最高值0.674 mg；從10 h 40 min進(jìn)入囊胚期開始，胚體質(zhì)量呈現(xiàn)平穩(wěn)的波動直至79 h 35 min的器官形成期末期，此后胚體質(zhì)量急劇降低并在孵化期時達(dá)到0.373 mg。根據(jù)不同發(fā)育時期胚體質(zhì)量的平均值得出，胚體在卵裂期體質(zhì)量為0.509 mg；之后快速增長并在原腸期達(dá)到最高值0.574 mg；此后急劇降低，在孵化時胚體質(zhì)量達(dá)到最低值0.373 mg，較之原腸期，降幅為35.0 %。

2.4不同發(fā)育期胚體RNA/DNA比率

魚類的生長跟蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)，而RNA是核糖體的組成成分，DNA含量穩(wěn)定，能影響細(xì)胞的生長率。RNA和DNA在魚類生長發(fā)育過程中有重要作用。大菱鲆胚胎RNA/DNA比率隨發(fā)育期的變化如圖4所示。胚體的RNA/DNA比率從受精卵開始至卵裂期呈現(xiàn)相對平穩(wěn)的波動，進(jìn)入囊胚期后，該比值快速增高并在受精后11 h 50 min的低囊期達(dá)到最高值14.454；之后，比率急劇降低，在受精后24 h的原腸期達(dá)到4.564，在29 h 30 min波動至9.139；此后，該比率保持較低的平穩(wěn)水平直至65 h。在受精后79 h 35 min，該比率升至7.055；但在103 h的孵化期，該比率降至最低值2.839。根據(jù)不同發(fā)育時期胚體RNA/DNA比率的平均值得出，RNA/DNA比率由卵裂期(7.523)到囊胚期(10.011)整體呈上升趨勢，之后保持下降狀態(tài)。

圖3　不同發(fā)育期胚體質(zhì)量Fig.3　Embryonic body mass during different developmental stages

圖4　不同發(fā)育期胚體RNA/DNA比率Fig.4　RNA/DNA ratio of embryo during different developmental stages

2.5不同發(fā)育期胚體蛋白質(zhì)/DNA比率

不同發(fā)育期胚體蛋白質(zhì)/DNA比率見圖5所示，不同于RNA/DNA的變化趨勢，蛋白質(zhì)/DNA比率比較平穩(wěn)、變化幅度較小。該比率最小值為43.152，出現(xiàn)在受精后86 h的器官形成期的末期；最大值為58.608，出現(xiàn)在受精后7 h 30 min的128細(xì)胞期。根據(jù)不同發(fā)育時期胚體蛋白質(zhì)/DNA比率的平均值得出，蛋白質(zhì)/DNA比率由卵裂期開始呈現(xiàn)“降低—升高—降低—升高”式波動，在卵裂期、囊胚期、原腸期、器官形成期、孵化期，該比率分別為51.867，48.264，50.093，47.520，49.536。蛋白質(zhì)/DNA比率變化趨勢跟RNA/蛋白質(zhì)類似。

2.6胚體形態(tài)性狀和胚體質(zhì)量與生化指標(biāo)間的關(guān)系

以核酸和總蛋白為基礎(chǔ)的生化指標(biāo)跟胚胎長度(ED)、油球直徑(OD)、胚體質(zhì)量(BW)間的關(guān)系如表1所示。數(shù)據(jù)表明，胚胎形態(tài)性狀和質(zhì)量跟生化指標(biāo)間均為“二項式”關(guān)系。由關(guān)系式系數(shù)可看出，RNA/DNA比率是與胚胎形態(tài)性狀和胚體質(zhì)量關(guān)系密切的生化指標(biāo)。

3　討論

本實驗中大菱鲆胚體長度經(jīng)歷“縮小—膨大—再縮小—再膨大”的變化過程，胚體形態(tài)的變

表1胚體長度(ED)、油球直徑(OD)、胚體質(zhì)量(BW)與RNA/DNA、蛋白質(zhì)/DNA、RNA/蛋白質(zhì)間的關(guān)系式化趨勢跟其內(nèi)部的細(xì)胞運動以及器官發(fā)育密切相關(guān)[17]。其中，在細(xì)胞數(shù)量急劇增多的卵裂期和下包運動劇烈的原腸期，胚體均出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象，而在其他時期表現(xiàn)為增大的趨勢，特別是在發(fā)育的最后階段，胚體膨大明顯，分析原因可能是機(jī)體通過增大自身體積來吸收外部的水分，以此來提高胚體內(nèi)的壓力，幫助胚體沖破胚膜順利孵出。胚體發(fā)育過程中，油球在卵裂期之后呈現(xiàn)持續(xù)下降的狀態(tài)，說明隨著細(xì)胞活動和組織分化程度的逐步升高，機(jī)體耗能量增大，對油球中脂類和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)的利用比率也逐漸增加。此外，胚體質(zhì)量隨著發(fā)育期也呈現(xiàn)不同的變化趨勢，最高值發(fā)生在原腸期，而最低值則出現(xiàn)在孵化期。

Table 1The relationships among embryonic length (ED)，oil globule diameter (OD)，embryonic body mass (BW) with RNA/DNA，protein/DNA，RNA/protein ratios

關(guān)系式R2值ED=2.9963(RNA/DNA)2-57.341RNA/DNA+2065.20.786*OD=0.1318(RNA/DNA)2-4.2301RNA/DNA+349.250.537BW=0.0026(RNA/DNA)2-0.0462RNA/DNA+0.72670.683ED=-0.2062(protein/DNA)2+15.982protein/DNA+1553.50.635OD=-0.0293(protein/DNA)2+3.1291protein/DNA+245.330.315BW=-0.0007(protein/DNA)2+0.0615protein/DNA-0.88880.525ED=-16441(RNA/protein)2+4512.7RNA/pro-tein+1553.50.487OD=-2337.1(RNA/protein)2+883.5RNA/pro-tein+245.330.137BW=-52.164(RNA/protein)2+17.367RNA/protein-0.88880.383

注：*代表相關(guān)關(guān)系顯著(P<0.05)。

圖5　不同發(fā)育期胚體蛋白質(zhì)/DNA比率Fig.5　Protein/DNA ratio of embroy during different developmental stages

在生物體內(nèi)，遺傳物質(zhì)DNA含量是相對穩(wěn)定的，反映的是機(jī)體的細(xì)胞數(shù)量，而遺傳物質(zhì)RNA的含量則與蛋白質(zhì)的合成聯(lián)系緊密[18-19]。由于仔稚魚的生長依賴于蛋白的合成，再加之以核酸為基礎(chǔ)的參數(shù)對仔稚魚的攝食變化反應(yīng)靈敏，所以核酸和蛋白指標(biāo)是評價仔稚魚生長的有效參數(shù)[20-21]。目前，DNA，RNA和蛋白指標(biāo)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于魚類仔稚魚和幼魚生長發(fā)育的評價，Park等[22]分析了亞洲油鰈變態(tài)前仔稚魚生長和RNA/DNA比率的變化；Mercaldo-Auen等[23]建立了用RNA/DNA比率來評估隆頭魚生長的關(guān)系式；Mercaldo-Allen等[24]研究了冬鲆RNA/DNA與生長的數(shù)量關(guān)系；Gwack等[25]通過測定饑餓狀態(tài)和投喂?fàn)顟B(tài)下牙鲆的RNA/DNA，建立了用RNA/DNA比率來評價仔稚魚營養(yǎng)狀況的方法。但是，魚類胚胎期生長發(fā)育與核酸和蛋白指標(biāo)間關(guān)系的研究卻鮮有報道。本實驗中，大菱鲆胚胎發(fā)育階段，胚體RNA/DNA比率平均值的最高值出現(xiàn)在囊胚期，之后保持不同幅度的下降趨勢并且在孵化期出現(xiàn)最低值。而蛋白質(zhì)/DNA比率進(jìn)入卵裂期之后，經(jīng)歷囊胚期、原腸期、器官形成期、孵化期，不同時期該比率的變化趨勢為“降低—升高—降低—升高”。上述核酸和總蛋白指標(biāo)的變化表明，大菱鲆胚胎進(jìn)入卵裂期后細(xì)胞不斷分裂，胚體的生長以細(xì)胞增殖為主直至囊胚期；之后的胚體生長以細(xì)胞增大為主直至原腸期；胚胎進(jìn)入原腸期后胚盤中細(xì)胞不斷下包，胚體的生長以細(xì)胞增殖為主直至器官形成期；之后胚體生長以細(xì)胞增大為主直至孵出，即：大菱鲆胚體的生長是細(xì)胞增殖和細(xì)胞增大周期性交替的過程。

本實驗中，筆者對胚體長度、油球直徑、胚體質(zhì)量與核酸、總蛋白等生化指標(biāo)進(jìn)行了統(tǒng)計分析，建立了相關(guān)指標(biāo)間的關(guān)系式。結(jié)果顯示，胚體形態(tài)性狀和質(zhì)量跟生化指標(biāo)間均為“二項式”關(guān)系，而且RNA/DNA比率是與胚胎形態(tài)性狀和胚體質(zhì)量關(guān)系密切的生化指標(biāo)。

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(責(zé)任編輯盧福莊)

Relationship between embryonic growth and nucleic acids of Scophthalmus maximus

TONG Xue-hong1，2，TANG Xin-hui2，BAO Cheng-man2，YANG Xiao-lan2，CHEN Qian2，TAO Ping2

(1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Wetland Bioresources and Environmental Protection，Yancheng 224051，China;2.College of Ocean and Biological Engineering，Yancheng Teachers University，Yancheng 224051，China)

Embryonic development of turbot (Scophthalmus maximus) was studied，and the growth characteristics as well as the changes of nucleic acids and proteins were analyzed to establish the relationship between growth traits and biochemical indexes.The major results were as follows:(1) Embryonic length changed according to the tendency of “decrease-enlargement-decrease-enlargement” at different stages，and reached the minimal value of 0.998 mm at 5 h 40 min after fertilization and the maximal value of 1.089 mm at hatching.(2) Diameter of oil globule increased till cleavage stage and decreased thereafter with the appearance of the highest value of 0.192 mm at 9 h 40 min and the lowest value of 0.176 mm at 65 h.(3) Embryonic body mass increased before gastrula stage and decreased thereafter，and presented the minimal value of 0.340 mg at 7 h 30 min and the maximal value of 0.674 mg at 9 h 40 min.(4) The changes of RNA/DNA and protein/DNA ratios showed that embryonic growth was dominantly hyperplastic till blastula stage，hypertrophical till gastrula stage，hyperplastic till segmentation stage and hypertrophical till hatching，indicating that embryonic growth was periodic alternation of hyperplasia and hypertrophy.(5) The relations were binomial among morphological traits，body mass and biochemical indicators，and RNA/DNA ratio was closely correlated with growth traits.

turbot;embryonic development;nucleic acids；RNA/DNA

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):428-434http://www.zjnyxb.cn

佟雪紅，湯新慧，鮑成滿，等.大菱鲆胚胎生長與核酸關(guān)系的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(3):428-434.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.11

2015-09-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(31340007)；江蘇省鹽土生物資源研究重點實驗室開放課題(JKLBS2014011)；江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項目(12KJB240001)；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410324012)；鹽城師范學(xué)院教授、博士基金項目(6207110006)

佟雪紅(1979—)，女，山東濰坊人，博士，講師，從事魚類生理學(xué)研究。E-mail∶txh113005@163.com。

S965.3

A

1004-1524(2016)03-0428-07