李萬金，黃燕，呂璐冶，韓秋影，周濤，陳亮

國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850

乳腺癌作為女性腫瘤致死最主要的原因，其病理特征與治療靶點具有多樣性[1-3]。根據(jù)腫瘤的分子分型，乳腺癌可分為三陰乳腺癌、Luminal A 型、Luminal B 型及 HER2 過表達(dá)型等 4 種亞型，其中15%～20% 為三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）[4-6]。與其他 3 種亞型不同，三陰乳腺癌同時缺乏雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、表皮生長因子受體2（HER2）3 種靶點的表達(dá)，所以傳統(tǒng)的內(nèi)分泌治療和靶點治療對其治療效果并不理想[7-9]。因此，針對三陰乳腺癌的治療，亟需探尋新的靶點與策略[10-11]。

polo 樣激酶1 相關(guān)檢查點解旋酶（polo-like kinase1-interacting checkpoint helicase，PICH）屬于SNF2 家族，具有DNA 解旋酶活性，是有絲分裂后期姐妹染色單體分離的重要調(diào)控分子[12-13]。研究表明，作為有絲分裂關(guān)鍵調(diào)控激酶CDK1、PLK1的磷酸化底物，PICH 在有絲分裂期被招募至著絲粒，與BLM、TOPⅡ形成復(fù)合物，進(jìn)而通過水解ATP 提供能量，保證姐妹染色單體在細(xì)胞有絲分裂后期正確分離；當(dāng)PICH 缺失時，著絲粒DNA 不能正常斷裂，導(dǎo)致微核或多核的產(chǎn)生，嚴(yán)重時造成細(xì)胞分裂異常[14-16]。此外，有研究表明PICH 在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用[17]。

本實驗室前期研究表明三陰乳腺癌患者的腫瘤組織中PICH 呈高表達(dá)，且PICH 高表達(dá)的患者預(yù)后較差，提示PICH 可能參與調(diào)控三陰乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。為了驗證這一想法，我們構(gòu)建了可誘導(dǎo)穩(wěn)定敲低PICH的三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、HEK293T 細(xì)胞購于ATCC，由本實驗室凍存保種；大腸桿菌DH5c 感受態(tài)細(xì)胞、2×上樣緩沖液購于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；嘌呤霉素抗性的pLKO.1-tet-on 載體質(zhì)粒購于 Addgene 公司；DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗（青霉素、鏈霉素）及鈣轉(zhuǎn)試劑盒購于邁晨科技有限公司；胎牛血清購于Gibco 公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、AgeⅠ及T4DNA 連接酶購于賽默飛世爾有限公司；瓊脂糖購于GenStar 公司；PICH 抗體和Tubulin 抗體分別為Sigma 公司和CST 公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10%胎牛血清及1%雙抗），MDA-MB-231 細(xì)胞用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10%胎牛血清及1%雙抗）。

1.3 PICH shRNA設(shè)計

從 Public TRC Portal 數(shù)據(jù)庫（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/）中選取人源PICH特異的shRNA 序列，且該序列適用于pLKO.1 載體構(gòu)建（表1、2）。

1.4 PICH shRNA慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用ddH2O 將合成的PICH 干涉引物稀釋至100 mmol/L；各取1.25 μL 互補(bǔ)單鏈與5 μL 10×退火緩沖液加入42.5 μL ddH2O 中混勻，將混合液置于95℃水中加熱10 min 后，緩慢冷卻至室溫，完成引物退火；取5 μg pLKO.1-tet-on 載體質(zhì)粒與5 μL 10×酶切緩沖液混合，再用ddH2O 補(bǔ)齊至45 μL，最后分別加入2.5 μLEcoRⅠ和AgeⅠ酶，配成酶切體系，37℃酶切4 h；利用核酸電泳分離酶切產(chǎn)物，并回收酶切片段產(chǎn)物；各取1 μL酶切回收產(chǎn)物、10× T4緩沖液、T4DNA 連接酶與7 μL 退火產(chǎn)物混勻配成10 μL 連接體系，37℃連接 1 h；取 5 μL 連接產(chǎn)物加入 50 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞溶液中混勻，配成轉(zhuǎn)化體系，冰浴30 min；快速將轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)移到42℃水浴鍋中熱激 90 s，冰浴 2～3 min；取 400 μL 不含抗生素的無菌LB 液體培養(yǎng)基加入裝有轉(zhuǎn)化體系的試管中，于37℃搖床上孵育1 h；室溫低速離心3 min，棄300 μL 上清，重懸菌液后，均勻涂在含氨芐青霉素的LB 平板上，37℃培養(yǎng)箱中過夜；菌落PCR鑒定，基因測序驗證。

表1 PICH干涉靶序列

表2 PICH干涉序列

1.5 慢病毒包裝與感染

每個 10 cm 培養(yǎng)皿接種約 1×106HEK293T 細(xì)胞；取6μg目的質(zhì)粒、4.5 μg psPAX2、1.5 μg pVSV-G 充分混勻于 1 mL HBS 中，靜置 5 min；取67 μL CaCl2緩慢滴加到混合液中，充分吹打混勻，靜置20 min；將轉(zhuǎn)染體系均勻緩慢地滴加至HEK293T 培養(yǎng)皿中，12 h 內(nèi)更換培養(yǎng)基；收集病毒，并濃縮至約500 μL；取適量濃縮后的病毒及促感染劑聚凝胺（polybrene，10 μg/mL）滴加至MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)基中；24 h 后加入工作濃度為2 μg/mL的嘌呤霉素，篩選帶有抗性的細(xì)胞。

1.6 PICH敲低效果及細(xì)胞增殖檢測

按照2 μg/mL的工作濃度將強(qiáng)力霉素（doxy?cycline，DOX）加入上述完成篩選的細(xì)胞培養(yǎng)基中，72 h 后將細(xì)胞接種于96 孔板中（2×103/孔），每組平行3 個復(fù)孔，分別于0、1、2、3、4、5 d 用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測每組細(xì)胞的D490nm值；剩余細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，通過Western 印跡檢測PICH蛋白的敲低效果。

2 結(jié)果

2.1 pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

通過檢索數(shù)據(jù)庫，合成了2 條不同的shRNA引物，經(jīng)高溫變性、退火后得到引物二聚體。用核酸限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ與AgeⅠ對pLKO.1-teton-Puromycin 載體進(jìn)行酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段（圖1）。將酶切載體與引物二聚體連接后轉(zhuǎn)化、涂板，培養(yǎng)得到單克隆菌落。以單克隆菌落為模板進(jìn)行菌落PCR，利用核酸凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物（圖2），篩選出陽性克隆并測序。測序結(jié)果與干涉序列模板的比對結(jié)果表明PICH的干涉序列成功插入載體且無堿基突變（圖3），pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin 質(zhì)粒構(gòu)建成功。將鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為Tet-on-shPI?CH-1#、Tet-on-shPICH-2#。

2.2 DOX誘導(dǎo)PICH敲低效果檢測

為了得到攜帶目的質(zhì)粒的病毒，我們利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染體系，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。在MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)基中滴加適量病毒，感染24 h 后進(jìn)行抗性篩選，得到嘌呤霉素抗性細(xì)胞。用DOX 對篩選得到的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，96 h 后收集細(xì)胞樣品，Western 印跡檢測PICH的表達(dá)效果。結(jié)果顯示，加入DOX 后，穩(wěn)定表達(dá)Tet-on-shPICH-1#或Tet-on-shPICH-2#的2 組細(xì)胞中PICH的表達(dá)水平均明顯降低，而對照組（Tet-on-shNC）無明顯變化（圖4）。

2.3 PICH敲低抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖

篩選得到的細(xì)胞經(jīng)DOX 誘導(dǎo)48 h 后，計數(shù)種在96 孔板中并繼續(xù)誘導(dǎo)，分別在接種后的第0、1、2、3、4、5 d 用MTT 法檢測各孔細(xì)胞的D490nm值，評價細(xì)胞活力和增殖能力。結(jié)果表明，隨著PICH表達(dá)量的逐步降低，MDA-MB-231的細(xì)胞增殖受到顯著抑制（圖5，P＜0.001）。

圖1 pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin雙酶切電泳結(jié)果

圖2 菌液PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒測序結(jié)果（片段插入?yún)^(qū)域33～97bp）

圖4 DOX誘導(dǎo)下PICH的表達(dá)量檢測

圖5 MTT法檢測PICH敲低對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響（***P＜0.001）

3 討論

隨著社會節(jié)奏的加快，女性的工作和生活壓力越來越大，乳腺癌患者的數(shù)量也在逐年增加，其中三陰乳腺癌以其高轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、生存率低等特點成為亟待解決的難題[1-3]。因此，針對三陰乳腺癌治療的新靶標(biāo)的尋求具有重要意義。

PICH 是細(xì)胞有絲分裂過程中姐妹染色單體分離的重要調(diào)控分子。細(xì)胞分裂后期，它與Plk1結(jié)合在著絲粒DNA 上，保證著絲粒DNA 正常斷裂及細(xì)胞有絲分裂正常進(jìn)行[14]。研究表明，PICH 在乳腺癌和腎癌中呈高表達(dá)，并且高表達(dá)PICH的腫瘤患者預(yù)后較差[18]，但其中具體的分子機(jī)制并不清楚。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)三陰乳腺癌患者的腫瘤組織中PICH 呈高表達(dá)，并且PICH 高表達(dá)的腫瘤患者預(yù)后較差。那么PICH 在三陰乳腺癌中的功能是怎樣的？為了解答這一問題，本研究中，我們利用慢病毒感染體系構(gòu)建可誘導(dǎo)穩(wěn)定敲低PICH的三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，該細(xì)胞系可通過DOX的加入實現(xiàn)PICH 在特定條件下的穩(wěn)定、可逆性敲低。利用該細(xì)胞系，我們初步證明了PICH 能夠促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞增殖。該細(xì)胞系的構(gòu)建，為我們后續(xù)深入探索PICH 在三陰乳腺癌中的功能及其具體的分子機(jī)制奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。