郭 旭， 陳乃東， 陳乃富， 張艷晴， 王榮花， 徐文冬， 石敏珠

(1.皖西學(xué)院， 安徽 六安 237012； 2.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué) 士官學(xué)校， 河北 石家莊 050083)

游離氨基酸是指天然產(chǎn)物中以游離狀態(tài)存在的氨基酸，是一種重要生物活性物質(zhì)[1]，具有維護(hù)新陳代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫等功能[2-4]，在食品、藥品及藥用植物中廣泛存在，是中藥治療疾病或滋補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)的主要成分之一，是評(píng)價(jià)中藥材或食品品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。河南石斛(Dendrobiumhenanense)屬于蘭科石斛屬[5]，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[6]，具有很高的藥用和觀賞價(jià)值[7]。然而，對(duì)于河南石斛化學(xué)成分的研究尚處于起步階段。為此，筆者等以河南石斛中游離氨基酸的提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其游離氨基酸的超聲輔助提取工藝條件進(jìn)行篩選，為河南石斛藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及資源開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1石斛于2018年4月采自安徽省霍山縣，經(jīng)鑒定為河南石斛(Dendrobiumhenanense)。

1.1.2儀器電子分析天平(FA1004型，上海精科有限公司)、BenchTop Pro冷凍干燥機(jī)(SP Scientific，USA)、雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、超聲波清洗儀(東莞市協(xié)和超聲波設(shè)備有限公司)等。

1.1.3試劑甘氨酸(石家莊東華金龍化工有限公司)、磷酸二氫鉀(廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心)、氫氧化鈉(西隴科學(xué)股份有限公司)、茚三酮(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)、無(wú)水乙醇(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取1.0 mg/mL甘氨酸溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于刻度試管中，以蒸餾水補(bǔ)足至10.0 mL。吸取上述各溶液2.0 mL于10 mL刻度試管中，分別加入2%茚三酮溶液1.0 mL和pH 6.8的磷酸緩沖液1.0 mL，震蕩搖勻，于100℃水浴中加熱15 min后冷卻，蒸餾水定容至刻度，以0.0 mg/mL甘氨酸為空白對(duì)照，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=16.34C+0.034，R2=0.991，式中，A為吸光度，C甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度。

1.2.2提取工藝條件單因素試驗(yàn)取河南石斛新鮮莖，洗凈、切片，-50℃冷凍干燥至恒重，粉碎。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用60%甲醇為提取劑[8-10]，固定超聲提取溫度為60℃，精密稱(chēng)取0.5 g干燥至恒重的河南石斛粉末若干份，按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，3次重復(fù)，考察超聲提取時(shí)間、超聲提取功率、料液比和超聲提取次數(shù)對(duì)河南石斛游離氨基酸提取得率的影響。

表1不同因素提取河南石斛游離氨基酸的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及水平

1.2.3提取工藝條件響應(yīng)面試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比、超聲提取時(shí)間、超聲提取功率、超聲提取次數(shù)4個(gè)影響因素，以河南石斛中游離氨基酸的提取得率為響應(yīng)值(y)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行4因素3水平(表2)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)建模，確定超聲波輔助提取的最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析采用Design-Expert10.0完成，最后進(jìn)行最佳工藝條件的驗(yàn)證和加樣回收試驗(yàn)。

1.2.4游離氨基酸提取得率的測(cè)定精密吸取1.2.2、1.2.3所述試驗(yàn)條件下提取的河南石斛提取液1.0 mL置于10.0 mL刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法在570 nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中游離氨基酸濃度，進(jìn)而計(jì)算出游離氨基酸的提取得率。

表2不同因素提取河南石斛游離氨基酸響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

從圖1可看出超聲提取時(shí)間、超聲提取功率、料液比和超聲提取次數(shù)對(duì)河南石斛總游離氨基酸提取得率的影響。

2.1.1料液比河南石斛游離氨基酸的提取得率隨著料液比的增加而增大，料液比為1∶50時(shí)達(dá)到最大值，但料液比為1∶40和1∶50時(shí)游離氨基酸的提取得率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇料液比1∶(20～40)做響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.2超聲提取時(shí)間當(dāng)超聲提取時(shí)間≤40 min時(shí)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)河南石斛游離氨基酸的提取得率顯著升高；超過(guò)40 min后，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)提取得率差異不顯著，超聲時(shí)間30 min時(shí)河南石斛粉末中游離氨基酸已基本被提取出來(lái)，故選擇超聲提取時(shí)間20～40 min為后續(xù)優(yōu)化的提取時(shí)間。

2.1.3超聲提取功率隨著超聲提取功率的增加河南石斛游離氨基酸的提取得率逐漸增加，超聲提取功率為240 W時(shí)達(dá)最大值，繼續(xù)加大超聲提取功率，提取得率下降。原因可能是超聲提取功率≤240 W時(shí)，超聲功率增加有利于粉末中游離氨基酸的溶出，但繼續(xù)增大超聲功率，提取液的流動(dòng)速度加快，造成粉末在超聲場(chǎng)中停留時(shí)間減少，導(dǎo)致破壁作用減弱[11]。綜合考慮，選擇超聲提取功率120～240 W做進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4提取次數(shù)隨著提取次數(shù)的增加河南石斛游離氨基酸的提取得率不斷增大，在提取4次時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定，再增加提取次數(shù)無(wú)顯著差異，故選2～4次做進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1不同因素下河南石斛總游離氨基酸的提取得率

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)

采用Design-Expert 10.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果(表3)進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程：

y=-4.242-0.022 2A+0.107 9B+0.017 1C+1.088D-0.000 025AB+0.000 017AC-0.001 25AD-0.000 096BC-0.005 25BD-0.000 75CD+0.000 4A2-0.000 76B2-0.000 02C2-0.079 7D2

經(jīng)方差分析(表4)，在各因素所選取的水平范圍內(nèi)，B、C、D、BC、BD、A2、B2、C2、D2所對(duì)應(yīng)的P值均小于0.05，說(shuō)明這幾個(gè)因素對(duì)河南石斛游離氨基酸的提取得率有顯著影響。根據(jù)F值大小可知，4個(gè)因素對(duì)河南石斛提取得率的影響為提取功率(C)>提取時(shí)間(B)>提取次數(shù)(D)>料液比(A)。

經(jīng)Design-Expert 10.0軟件分析，以60%乙醇體積為提取劑、超聲提取溫度60℃時(shí)，超聲波輔助提取河南石斛游離氨基酸的最佳工藝條件為料液比1︰39.85(g︰mL)、超聲時(shí)間30 min、超聲功率240 W、提取次數(shù)3.7次。在此條件下，預(yù)測(cè)的河南石斛中游離氨基酸含量為1.979%?？紤]實(shí)際操作條件，將條件定為料液比1︰40、超聲時(shí)間30 min、超聲功率240 W、提取次數(shù)4次。

表3河南石斛游離氨基酸提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

注：實(shí)測(cè)值為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

Note:Measured value is the mean value of three repetitions.

表4響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3最佳工藝條件的驗(yàn)證

2.3.1驗(yàn)證試驗(yàn)在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，河南石斛的游離氨基酸含量為(1.95±0.12)%，與理論值相近，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝條件相對(duì)可靠。

2.3.2加樣回收試驗(yàn)精密稱(chēng)取河南石斛樣品6份，各0.5 g，分別加入甘氨酸10.0 mg，按最佳工藝條件提取，計(jì)算回收率和RSD，測(cè)得加樣回收率在94.2%～103.5%，RSD=4.2%，加標(biāo)回收率滿足試驗(yàn)要求，表明本測(cè)定方法穩(wěn)定可靠。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法，通過(guò)二次回歸計(jì)算構(gòu)建河南石斛游離氨基酸提取得率與超聲提取時(shí)間、超聲提取功率、料液比、超聲提取次數(shù)關(guān)系的回歸模型，回歸方程：y=-4.242-0.022 2A+0.107 9B+0.017 1C+1.088D-0.000 025AB+0.000 017AC-0.001 25AD-0.000 096BC-0.005 25BD-0.000 75CD+0.000 4A2-0.000 76B2-0.000 02C2-0.079 7D2，R2=0.989 9，利用模型對(duì)影響超聲波輔助提取河南石斛游離氨基酸的4個(gè)關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行分析，得到最佳提取條件為料液比1︰40(g︰mL)、超聲時(shí)間30 min、超聲功率240 W、提取次數(shù)4次，在此條件下河南石斛的游離氨基酸含量為(1.95±0.12)%。