趙志新，張思瑾

（商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛726000）

三萜皂苷是植物界中一類重要的次生代謝產物，具有多種生物活性，其可增強植物抗病、抗蟲害的能力，還具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降低膽固醇、保肝等作用[1]。三萜皂苷合成途徑，其第一步是先通過甲羥戊酸等途徑生成異戊二烯焦磷酸，再經過催化酶鯊烯環(huán)氧酶等的催化，生成2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶，環(huán)化形成三萜類骨架，然后通過細胞色素p450、糖基轉移酶、β-糖苷酶的修飾作用，最后形成糖苷化合物——三萜皂苷[2]。糖基轉移酶（GT,Glycosyltransferase）作為三萜皂苷生物合成的最后一步，對其基因的克隆以研究植物抗病機理及藥用植物次生代謝調控機制目前已深入到了分子水平[3]。糖基轉移酶在植物的生長發(fā)育過程和次生代謝調節(jié)方面起著重要作用[4]，經過糖基化修飾的受體分子能改變其在細胞內溶解性、穩(wěn)定性和區(qū)域定位等特性，還能調節(jié)信號傳導、細胞周期、應答反應、蛋白表達調控和清除細胞[5]。一直以來，對于糖基轉移酶的研究多是以擬南芥為材料，近年來雖然有植物糖基轉移酶體外生物化學方面的研究，但在糖基轉移酶結構域和功能關系方面的研究進展還相對緩慢[6]。本研究利用生物信息學分析工具，首先搜集GenBank中已公布的植物糖基轉移酶序列，然后使用生物信息學工具對糖基轉移酶序列的保守結構域以及親緣進化關系進行分析，為以后研究糖基轉移酶酶學特征及三萜皂苷代謝提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

首先查找有關植物GT相關文獻，然后依據查找文獻并GenBank搜索，獲得已公布的16種植物GT序列（見表1）。

表1 獲得的具有糖基轉移酶的植物

1.2 方法

使用NCBI提供的在線分析工具CDD（Conserved Domain Database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白質序列保守結構域；使用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，分析所搜集的植物中GT進化關系。

2 結果與分析

2.1 保守結構域的預測和分析

圖1為CDD工具顯示紅景天保守結構域結果；同樣，利用CDD工具對其余15條序列進行保守結構域預測分析，結果見表2。

圖1 紅景天GT保守結構域分析

從圖1可以看出，紅景天GT氨基酸序列有一個GTB糖基轉移酶超家族，有三類不同的保守結構域，分別為活性位點結構域（active site）、底物結合保守結構域（substrate-binding pocket）和TDP結合位點結構域（TDP-binding site）。其他植物GT也都屬于GTB超家族（Accession登錄號：Cl10013），具有統(tǒng)計極顯著性（E<8.95×10-49），主要參與催化糖類轉移的生物學功能。

表2 糖苷轉移酶序列保守結構域

2.2 構建糖基轉移酶系統(tǒng)進化樹

使用MEGA 6.0軟件對16種植物的GT序列構建進化樹，采用不同算法以比較所構建樹的差異，進而分析其親緣關系。

2.2.1 Maximum Likelihood Tree算法構建進化樹

依據Maximum Likelihood Tree算法（圖2），這16種植物的GT序列可以分為三大類，滇牡丹（芍藥科）和蒺藜苜蓿（豆科）為一類；野葛（蝶形花科）、北柴胡（傘形科）、七彩紅竹（禾本科）和薔薇（薔薇科）聚為一類；其余的植物中，花生（豆科）為一個亞類，剩余的紅景天等聚為一個亞類。進化關系顯示，七彩紅竹（禾本科）和薔薇（薔薇科）、三七（五加科）和黑莓（薔薇科）、桉樹（桃金娘科）和白蘇子（唇形科）、紅景天（景天科）和毛白楊（楊柳科）它們兩兩之間糖基轉移酶進化關系最近。

2.2.2 Neighbor-joining Tree算法構建進化樹

使用Neighbor-joining Tree算法構建的進化樹顯示（圖3），這16種植物的氨基酸序列明顯地分為三大類，北柴胡（傘形科）、薔薇（薔薇科）、七彩紅竹（禾本科）、紅景天（景天科）、毛白楊（楊柳科）、野葛（蝶形花科）聚為一類；黑莓（薔薇科）、蒺藜苜蓿（豆科）、三七（五加科）、天山雪蓮（菊科）、桉樹（桃金娘科）、白蘇子（唇形科）為一類；花生（豆科）、刺五加（五加科）、滇牡丹（芍藥科）、石榴（石榴科）為一類。其中毛白楊（楊柳科）和野葛（蝶形花科）、薔薇（薔薇科）和北柴胡（傘形科）、滇牡丹（芍藥科）和石榴（石榴科）、桉樹（桃金娘科）和白蘇子（唇形科）、三七（五加科）和天山雪蓮（菊科）、黑莓（薔薇科）和蒺藜苜蓿（豆科）它們兩兩之間糖基轉移酶進化關系最近。

圖2 Maximum Likelihood Tree算法

圖3 Neighbor-joining Tree算法

2.2.3 Maximum Parsimony Tree算法構建進化樹

由圖4可以看出，16種植物分為三大類，及野葛（蝶形花科）為一類；薔薇（薔薇科）、七彩紅竹（禾本科）、北柴胡（傘形科）、桉樹（桃金娘科）、黑莓（薔薇科）、蒺藜苜蓿（豆科）為一類；滇牡丹（芍藥科）、石榴（石榴科）、刺五加（五加科）、花生（豆科）、白蘇子（唇形科）、紅景天（景天科）、毛白楊（楊柳科）、天山雪蓮（菊科）、三七（五加科）為一類。薔薇（薔薇科）和七彩紅竹（禾本科）、紅景天（景天科）和毛白楊（楊柳科）、滇牡丹（芍藥科）和石榴（石榴科）它們兩兩之間糖基轉移酶進化關系最近。

綜合比較三種不同算法所構建的進化樹，可以明顯看出三種算法所得結果差異較大，說明這16種植物的糖基轉移酶序列總體變異不大，進化上比較保守，以至于不同算法的影響遠大于物種本身的差異。同時也表明算法對進化樹構建結果影響較大，要審慎選擇不同的進化樹構建算法。

圖4 Maximum Parsimony Tree(s)算法

3 討論與結論

糖基轉移酶催化的糖基化反應是三萜皂苷生物合成的最后一步，使得單糖與三萜皂苷苷元由糖苷鍵相連。本文通過使用生物信息學方法，顯示16種植物的保守結構域都屬于GTB超家族，主要參與催化糖類轉移的生物學功能，表明糖基轉移酶的功能結構域具有高度的保守性。進化分析表明，16種植物GT基因大致被分為三類，滇牡丹（芍藥科）和石榴（石榴科）、紅景天（景天科）和毛白楊（楊柳科）、薔薇（薔薇科）和七彩紅竹（禾本科）它們兩兩之間糖基轉移酶進化關系最近，說明GT基因在進化上具有一定的保守性，這與野葛中的研究結果相類似[7]，同時研究顯示藥用植物中鯊烯環(huán)氧酶進化也比較保守[8]，這與本文研究相一致。同時許多基因組數據表明，糖基轉移酶基因在進化上不是獨立的，在糖基轉移酶基因家族中，旁系同源基因更易被選擇；代謝途徑中存在基因共調節(jié)和蛋白相互作用；代謝途徑中某些化合物相互排斥；糖基轉移酶進化還依賴基因重復，主要是串聯(lián)重復，而不是片段重復[9]。因為酶的功能表現(xiàn)最終是催化代謝反應，對于糧食或藥用植物來說與有效成分的生成或積累相關，本研究顯示糖基轉移酶在保守結構域和進化中都顯示較高的保守性，因此建議下一步研究與糖基轉移酶表達相關的三萜皂苷產物是否也有類似的特性，以指導人們開發(fā)和利用相近的植物資源。本文對糖基轉移酶的生物信息學分析，可為以后研究GT酶學特征及三萜皂苷代謝提供幫助。