朱 晨，劉 偉，李 璟，陳志杰，李 嬋，周玉婷，莫志賢

(南方醫(yī)科大學(xué)1. 中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)教研室、2. 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

鉤藤堿是常用中藥鉤藤的主要活性成分，長(zhǎng)期用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如高血壓、頭痛、中風(fēng)等[1]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿可以通過(guò)減少酪氨酸羥化酶的表達(dá)來(lái)抑制甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)依賴(lài)小鼠產(chǎn)生條件性位置偏愛(ài)(conditioned place-preference，CPP)[2]。谷氨酸受體1(glutamate receptor 1，GluR1)是中樞興奮性氨基酸受體，主要分布于突觸前。GluR1是α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異 唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)受體的關(guān)鍵亞型之一，與相應(yīng)的配體結(jié)合后可產(chǎn)生興奮作用[3]。本研究利用斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型，聯(lián)合應(yīng)用行為學(xué)、免疫組化、Western blot等方法，研究中藥有效成分鉤藤堿對(duì)METH誘導(dǎo)斑馬魚(yú)CPP效應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑鹽酸甲基苯丙胺(國(guó)家麻醉品實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：1212-9802)；鉤藤堿(日本MATSUURA YKUGYO公司)；鹽酸氯胺酮注射液(規(guī)格：2 mL ∶0.1 g，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽(JL160318010，江萊生物公司); 抗GluR1抗體(MAB397，Millipore公司)；魚(yú)用生理鹽水，自配，NaCl濃度為100 mmol·L-1。

1.2 儀器Noldus EthoVision XT 8.5軟件(荷蘭Noldus公司)；ChemiImager 550凝膠成像儀(美國(guó)Alpha Innotech公司); Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國(guó) Media Cybernetics公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚(yú)(野生型，AB系，6～10個(gè)月)，♀♂各半，由南方醫(yī)科大學(xué)斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)中心提供。養(yǎng)魚(yú)系統(tǒng)為北京愛(ài)生公司凈水系統(tǒng)(水溫28.5 ℃)；魚(yú)用鹽水濃度為0.03%～0.04%；pH值為7.2～7.6；光照條件為14 h光照(8 ∶30 am-10 ∶30 pm)，10 h黑夜(10 ∶30 pm-8 ∶30 am)。

2 方法

2.1 CPP箱的制作斑馬魚(yú)CPP箱為長(zhǎng)16 cm、寬9 cm、高9 cm的魚(yú)缸，魚(yú)缸中間插入透明活動(dòng)擋板將其分隔成兩個(gè)箱體，其中一箱體涂成黑色，另一箱體涂成白色。抽開(kāi)透明擋板時(shí)，斑馬魚(yú)可在兩箱體間自由活動(dòng)。

2.2 斑馬魚(yú)基線(xiàn)測(cè)定斑馬魚(yú)適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后進(jìn)行基線(xiàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)前，將CPP箱中間的擋板抽開(kāi)，當(dāng)斑馬魚(yú)進(jìn)入箱中時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄斑馬魚(yú)15 min內(nèi)在兩箱體的停留時(shí)間(以頭部為準(zhǔn))。結(jié)果表明，≥95%的斑馬魚(yú)天性偏愛(ài)黑箱，因此，以在黑箱中的活動(dòng)時(shí)間>8 min為合格，剔除對(duì)白箱有明顯偏愛(ài)的斑馬魚(yú)。

2.3 CPP模型的復(fù)制與給藥將篩選合格的斑馬魚(yú)隨機(jī)分成5組：對(duì)照組、模型組、鉤藤堿低劑量組(50 mg·kg-1)、鉤藤堿高劑量組(100 mg·kg-1)、氯胺酮組(150 mg·kg-1)。實(shí)驗(yàn)前,記錄斑馬魚(yú)在CPP箱中15 min內(nèi)的活動(dòng)。d 1、3、5，除對(duì)照組外，其余組斑馬魚(yú)8 ∶00 am腹腔注射METH 40 mg·kg-1(對(duì)照組注射等體積生理鹽水)，之后放入白箱中訓(xùn)練45 min；d 2、4，同一時(shí)間全部組斑馬魚(yú)腹腔注射同體積生理鹽水，之后放入黑箱中訓(xùn)練45 min。d 1～5，給藥組斑馬魚(yú)8 ∶00 pm腹腔注射相應(yīng)藥物(對(duì)照組和模型組則注射等體積生理鹽水)。d 6，記錄各組斑馬魚(yú)在CPP箱中15 min內(nèi)的活動(dòng)。

2.4 免疫組化法檢測(cè)斑馬魚(yú)腦GluR1的表達(dá)斑馬魚(yú)行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，將其冷凍處死，剪下頭部，4%多聚甲醛固定24 h。頭部修剪整齊，進(jìn)行梯度脫水和石蠟包埋。切片機(jī)切片，厚度約5 μm，用防脫載玻片撈起后烤干，進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化。組織切片用PBS緩沖液沖洗后，用3% H2O2內(nèi)源常溫下封閉10 min后，進(jìn)行抗原修復(fù)。再次清洗之后，滴加5%正常小牛血清常溫封閉20 min。隨后加入一抗GluR1(1 ∶100)，4 ℃過(guò)夜;PBS漂洗3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，常溫 1 h；陰性對(duì)照用PBS液代替一抗。

2.5 Western blot檢測(cè)GluR1的表達(dá)斑馬魚(yú)行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，斑馬魚(yú)冷凍處死，顯微鏡下取出斑馬魚(yú)的腦組織，用RIPA裂解液和PMSF(50 ∶1)提取腦組織蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用牛奶常溫封閉2 h，1×TBST清洗3次后，加入稀釋好的一抗GluR1(1 ∶100)，4 ℃過(guò)夜；1×TBST清洗3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)，常溫1 h。洗去二抗，加入發(fā)光液，用凝膠成像儀獲取條帶圖像，以β-actin為內(nèi)參，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶。

3 結(jié)果

3.1 鉤藤堿對(duì)METH依賴(lài)斑馬魚(yú)行為學(xué)的影響用Noldus EthoVision XT8.5軟件分析斑馬魚(yú)訓(xùn)練前后在白箱中的逗留時(shí)間差及活動(dòng)軌跡(斑馬魚(yú)訓(xùn)練前后在白箱中逗留時(shí)間的差值=斑馬魚(yú)訓(xùn)練后在白箱中的停留時(shí)間-斑馬魚(yú)訓(xùn)練前在白箱中的逗留時(shí)間)。如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，腹腔注射METH 40 mg·kg-1后，模型組斑馬魚(yú)在白箱中停留時(shí)間明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿高劑量組斑馬魚(yú)在白箱中的停留時(shí)間明顯減少(P<0.01)。各組斑馬魚(yú)造模前后在CPP箱的活動(dòng)軌跡圖見(jiàn)Fig 2。

3.2 鉤藤堿對(duì)METH依賴(lài)斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測(cè)定各組斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1陽(yáng)性細(xì)胞的IOD值，每組各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)含量以平均值表示。如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯下調(diào)(P<0.01)。

Fig 1 Change of activity time of zebrafish

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

Fig 2 Road maps of zebrafish in CPP compartment before and after CPP train

Fig 3 Micrographs of GluR1 positive cells

A: Micrographs of GluR1 positive cells in zebrafish brain; B: The IOD of GluR1 positive cells in zebrafish brain in each group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

3.3 鉤藤堿對(duì)METH依賴(lài)斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，各組斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1蛋白的表達(dá)差異具有顯著性。與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組斑馬魚(yú)腦內(nèi)的GluR1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。

4 討論

全球約有3 000多萬(wàn)人使用安非他明類(lèi)興奮劑，METH是最常見(jiàn)的安非他明類(lèi)興奮劑之一，使用率約占71%。METH是一種具有強(qiáng)烈的中樞興奮作用的藥物，長(zhǎng)期使用后會(huì)造成機(jī)體多器官損傷、精神障礙等。

斑馬魚(yú)和人類(lèi)的早期發(fā)育極為相似。在基因水平上，斑馬魚(yú)與人之間的血液系統(tǒng)、內(nèi)臟器官、視覺(jué)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有85%的同一性。憑借其良好的繁殖能力、透明胚胎、生長(zhǎng)速度和人類(lèi)基因之間的相似性，斑馬魚(yú)受到越來(lái)越多生物學(xué)家的青睞。

Fig 4 GluR1 expression of zebrafish by Western

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

一些研究人員成功地建立了斑馬魚(yú)藥物依賴(lài)CPP模型，斑馬魚(yú)在成癮醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用被證明是可行的。Cachat等[4]建立了咖啡因、酒精、嗎啡和地西泮的斑馬魚(yú)成癮戒斷模型，并指出這些物質(zhì)可以影響斑馬魚(yú)的行為和內(nèi)分泌，證實(shí)斑馬魚(yú)可能成為藥物依賴(lài)性研究的模型。Ninkovic等[5]的研究表明，腹腔注射D-苯丙胺可以改變成年斑馬魚(yú)的位置偏好行為。

在本研究中，CPP測(cè)試的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)在白箱中的停留時(shí)間明顯增加；而在給予氯胺酮和鉤藤堿干預(yù)后，與模型組相比，斑馬魚(yú)在白箱中的停留時(shí)間明顯減少。這表明METH(40 mg·kg-1)可以誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生CPP效應(yīng)，氯胺酮(150 mg·kg-1)和鉤藤堿(100 mg·kg-1)可以逆轉(zhuǎn)該作用。

大量研究發(fā)現(xiàn)，AMPA受體亞基GluR1與藥物成癮密切相關(guān)。急性全身注射可卡因和METH，或者伏隔核局部注射安非他明可以引起GluR1含量的增加[6-7]。腹腔注射苯丙胺可以導(dǎo)致大鼠的前額皮質(zhì)和紋狀體神經(jīng)元活動(dòng)的變化，并且引起前額皮質(zhì)中GluA1磷酸化(pS845)的改變[8]。METH能夠誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸水平的升高，而腦內(nèi)GluR1水平的升高會(huì)加速藥物依賴(lài)的形成[3]。

在本研究中，與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明斑馬魚(yú)對(duì)METH依賴(lài)的形成可能與GluR1的表達(dá)增加有關(guān)。與模型組相比，氯胺酮(150 mg·kg-1)組和鉤藤堿(50、100 mg·kg-1)組斑馬魚(yú)腦GluR1表達(dá)明顯降低，此生物學(xué)結(jié)果和行為學(xué)結(jié)果基本一致。這些結(jié)果表明，GluR1可能參與藥物(METH)依賴(lài)性形成?，F(xiàn)代研究表明，鉤藤對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、抗癲癇、抗驚厥和對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用等。本團(tuán)隊(duì)早期研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿能明顯拮抗苯丙胺依賴(lài)大鼠產(chǎn)生CPP的效應(yīng)，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基蛋白表達(dá)上調(diào)，使METH依賴(lài)性大鼠腦內(nèi)的GluR2/3表達(dá)正常化[9-11]。

綜上所述，鉤藤堿能抑制斑馬魚(yú)產(chǎn)生METH依賴(lài)，其機(jī)制可能與抑制斑馬魚(yú)腦內(nèi)GluR1表達(dá)有關(guān)。然而，由于中藥的復(fù)雜機(jī)制，藥物依賴(lài)和GluR1的機(jī)制仍有待探索。